產(chǎn)品目錄

本試劑盒適用于從新鮮或冷凍的血清、血漿、淋巴液、尿液等無細(xì)胞體液中提取游離DNA。本試劑盒采用可以特異性結(jié)合核酸的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，樣品裂解后，游離DNA在高鹽條件下與硅膠膜結(jié)合，在低鹽、高pH值時(shí)游離DNA從硅膠膜上洗脫下來。本品可以處理0.1-1ml的液體樣本，配置的高效微量吸附柱洗脫體積可低至20μl。純化的DNA產(chǎn)量高、質(zhì)量好，最大限度去除蛋白、色素、脂類及其他抑制性雜質(zhì)污染，游離DNA得率與樣品的類型，儲(chǔ)存條件、時(shí)間以及個(gè)體間差異有很大關(guān)系。純化得到的游離DNA質(zhì)量穩(wěn)定、可靠，可直接用于PCR、熒光定量PCR和二代測(cè)序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

保存條件：吸附柱DF置于2～8℃保存1年，其他組分室溫(15～30℃)。

自備試劑：無水乙醇、異丙醇。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、適用于從新鮮或冷凍的血清、血漿、淋巴液、尿液等無細(xì)胞體液中提取游離DNA。

2、可以處理0.1-1ml的液體樣本，配置的高效微量吸附柱洗脫體積可低至20μl。

3、純化得到的游離DNA質(zhì)量穩(wěn)定、可靠，可直接用于PCR、熒光定量PCR和二代測(cè)序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)：

1、向蛋白酶K 中加入5ml的蛋白酶K 儲(chǔ)存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿長時(shí)間室溫放置。

2、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致提取量下降。

3、本試劑盒可以提取0.1-1ml液體樣品。

4、使用前請(qǐng)檢查Buffer CL、Buffer CB是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀，請(qǐng)將Buffer CL、Buffer CB于56℃水浴孵育重新溶解。

5、第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在Buffer CB中加入異丙醇，混合均勻，并在試劑瓶標(biāo)簽上做好標(biāo)記。

6、第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇，混合均勻，并在試劑瓶標(biāo)簽上做好標(biāo)記。

7、實(shí)驗(yàn)開始前請(qǐng)將水浴鍋預(yù)熱至60℃。

8、可將洗脫緩沖液Buffer EBL預(yù)熱至60℃后使用。

操作步驟：

1、向離心管(自備)中加入20μl 蛋白酶K 。

2、加入200μl血清/血漿樣本。

注意：當(dāng)樣品量超過200μl時(shí)，請(qǐng)等比例增加蛋白酶K 、Buffer CL和Buffer CB試劑用量，具體試劑加入量可參考附表。

3、加入160μl Buffer CL，顛倒混勻，劇烈震蕩至少30秒。

4、60℃孵育30分鐘，其間顛倒混勻數(shù)次。

注意：200μl 血清/血漿樣本60℃孵育10-15分鐘即可。

5、加入360μl Buffer CB(使用前檢查是否加入異丙醇)，震蕩至徹底混勻。

6、冰浴5分鐘，短暫離心，使管壁和壁蓋上的液體集中到管底。

7、將步驟6所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前檢查是否加入無水乙醇), 12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9、向吸附柱中加入750μl Buffer GW2(使用前檢查是否加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10、向吸附柱中加入750μl 無水乙醇，12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

11、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。

12、將吸附柱置于新的離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-100μl Buffer EBL或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1)如果下游實(shí)驗(yàn)對(duì)pH值敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH值低于7.0時(shí)洗脫效率不高。

2)將洗脫緩沖液Buffer EBL預(yù)熱至60℃后使用,且離心之前室溫孵育5分鐘，可以增加產(chǎn)量。

3)如果要提高DNA的終濃度，可以將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘。
4)因?yàn)楸４嬖谒械?/span>DNA會(huì)受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer EBL洗脫并于-20℃保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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