產(chǎn)品目錄

本試劑盒供了一種快速、簡單、高效的從血片中提取基因組DNA的方法。既適用于未加抗凝劑的血液，也可用于加入EDTA、檸檬酸鹽、肝素等抗凝劑的血液樣本。樣品裂解后，DNA被選擇性的吸附到硅基質(zhì)膜上。兩步漂洗后，高質(zhì)量的DNA被溶解到洗脫液中。純化得到的DNA無酶抑制劑和其他雜質(zhì)的殘留，A260/A280的比值在1.5-2.3。DNA最長可達(dá)50 kb，適用于PCR，Real-time PCR、Southern blotting等實驗。

自備試劑：無水乙醇

產(chǎn)品特點(diǎn)

1、適用于凝固血液樣本的高純度總DNA分離純化。

2、無需有機(jī)溶劑提取以及乙醇沉淀，徹底去除污染物及下游反應(yīng)抑制物，快速提取高品質(zhì)DNA。

實驗前準(zhǔn)備及重要注意事項：

1、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 儲存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿長時間室溫放置，避免反復(fù)凍融，避免反復(fù)凍融，以免影響其活性。

2、第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在Buffer GW1和Buffer PW2中加入無水乙醇，混合均勻，并在試劑瓶標(biāo)簽上做好標(biāo)記。

3、使用前請檢查Buffer GTL和Buffer GC是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀，請將Buffer GC和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解

4、將一個水浴鍋預(yù)熱至56℃，另一個水浴鍋預(yù)熱至70℃。

5、可將洗脫緩沖液Buffer GE預(yù)熱至70℃。

操作步驟：

1、向1.5ml離心管中加入20μl 蛋白酶K 溶液，然后再加入180μl Buffer GTL。

注意：若樣品數(shù)量較多，蛋白酶K 和Buffer GTL可按比例混合，然后將200μl混合物加入到1.5ml的離心管中。

2、將取下的干血片放入上一步中的離心管中，劇烈渦旋混勻并短暫離心。56℃孵育30-60分鐘，期間每隔10分鐘將離心管渦旋10秒。

3、加入200μl Buffer GC，徹底渦旋混勻。短暫離心后，70℃孵育10分鐘，期間每隔3分鐘將離心管渦旋10秒。

注意：加入Buffer GC后可能會產(chǎn)生白色沉淀，大部分情況下，在孵育過程中，沉淀會消失，沉淀不會影響后續(xù)的實驗。

4、待步驟3離心管中樣品降為室溫后加入100μl無水乙醇，輕輕顛倒混勻樣品，室溫放置5分鐘。短暫離心，將管壁內(nèi)壁的液體富集于離心管底。
儲存條件：室溫(15～30℃)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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