產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱(chēng)	英文名稱(chēng)	規(guī)格	貨號(hào)
酵母基因組DNA快速提取試劑盒(柱式吸附)	Yeast genomic DNA rapid extraction kit	50次	CS-01F99040

介紹

本試劑盒采用DNA吸附柱和獨(dú)特的溶液系統(tǒng)，適合于從多種來(lái)源的酵母培養(yǎng)物中快速簡(jiǎn)單地提取基因組DNA。約3ml處于指數(shù)生長(zhǎng)期的酵母培養(yǎng)液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質(zhì)量的基因組DNA。純化DNA產(chǎn)物可直接用于PCR、酶切和雜交等實(shí)驗(yàn)。酵母細(xì)胞經(jīng)lyticase處理去除細(xì)胞壁后，獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

試劑盒組份：

緩沖液YB————————————20ml

結(jié)合液CB————————————11ml

漂洗液WB————————————15ml

抑制物去除液IR—————————25ml

洗脫緩沖液EB——————————15ml

Lyticase(10U/μl)———————2500U

蛋白酶K凍干粉(20mg/ml)—————20mg

吸附柱AC————————————50個(gè)

收集管(2ml)——————————50個(gè)

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

3.快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品裂解后操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。

4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

注意事項(xiàng)：

1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類(lèi)似離心機(jī)。

2. 需要自備乙醇、異丙醇、β-巰基乙醇。

3. 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到37℃和70℃?zhèn)溆谩?/span>

4. 結(jié)合液CB 和抑制物去除液IR 中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5. 用戶(hù)需要自備Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巰基乙醇)。

配制方法：在600 ml 去離子水里面溶解182.2 克山梨醇，加入200 ml 0.5M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調(diào)節(jié)PH 值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.1%β-巰基乙醇(商品化的β-巰基乙醇摩爾濃度一般為14M)。

6. 菌體濃度檢測(cè)一般OD600 值為1 的時(shí)候,釀酒酵母細(xì)胞是1-2×10^7cells/ml，由于菌種和分光度計(jì)不同即使同樣細(xì)胞數(shù)量OD 值變化也很大，以上僅供參考。

7. 洗脫液EB 不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水

洗脫，但應(yīng)該確保批pH 大于7.5， pH 過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫DNA 應(yīng)該保存在－20℃。DNA 如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA 可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

儲(chǔ)存條件：室溫，有效期12個(gè)月。
本制品別名：柱式酵母DNA提取試劑盒

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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