產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
細胞凋亡DNA Ladder抽提試劑盒(分離基因組DNA)	Cells/Tissue Apoptosis DNA Ladder Extraction Kit	20次\|50次	CS-01F99038

介紹

本試劑盒選擇性從組織和細胞中分離提取凋亡DNA ladder，通過選擇性分離基因組DNA與凋亡DNA ladder，最大限度的減少了基因組DNA對凋亡DNA ladder的觀察干擾，因此顯著的提高了檢測敏感度，反應(yīng)可在微量離心管進行，2.5小時完成，快速方便；無需有機抽提，檢測靈敏度極高，可從約2000個凋亡細胞中檢測到DNA ladder。推薦起始細胞量為5～10×10^5 個，但投入的細胞量可在1×10^5～5×10^6之間變化。原則是總細胞中應(yīng)含有至少約1～2×10^4個凋亡細胞。多于2×10^4個凋亡細胞通?？色@得十分清晰的凋亡DNA ladder。本試劑盒也可用于從組織中提取凋亡DNA ladder。但與培養(yǎng)細胞相比，整體動物組織凋亡細胞出現(xiàn)的時間、部位、程度等規(guī)律性差往往造成難以準確取材，可能顯著影響實驗結(jié)果。但只要組織確實發(fā)生凋亡，有經(jīng)驗的用戶也可以使用本試劑盒從組織提取凋亡DNA ladder

試劑盒組份(50次)：

Extraction buffer ———10ml

10%SDS—————————1ml

Enzyme A————————1ml

Enzyme B————————1ml

Precipitant ——————7ml

為保持活性方便運輸，Enzyme B 客戶收到時為凍干粉，收到后加500μl 滅菌水（25 次）或者1ml 滅菌水（50次）溶解后－20℃保存。Enzyme A 和Enzyme B 為酶溶液，應(yīng)該避免反復(fù)凍融降低活性，如果要分多次使用，最好按照每次使用量分裝后－20℃保存。

注意事項

1. 溴化乙錠染色過度將降低DNA條帶檢測靈敏度，可用水沖洗凝膠10～30分鐘。如沖洗過頭可再用溴化乙錠復(fù)染?？捎酶`敏的DNA染色劑SYBR Green。也可進行丙烯酰胺DNA凝膠電泳和DNA銀染。

2. 對細胞進行干預(yù)處理后，凋亡可能僅在某一時間點或某一干預(yù)強度下最為明顯。需要進行預(yù)試驗確定最佳干預(yù)時間或強度。此時也可用凋亡小體/hoeschst染色試劑盒(ALH160)快速染色凋亡小體觀察。

3. 推薦起始細胞量為5～10×10^5 個，但投入的細胞量可在1×10^5～5×10^6之間變化。原則是總細胞中應(yīng)含有至少約1～2×10^4個凋亡細胞。多于2×10^4個凋亡細胞通?？色@得十分清晰的凋亡DNA ladder。六孔板的一個孔相當于一個35 mm培養(yǎng)皿長滿后可得到1～10×10^5 個細胞，如果細胞凋亡發(fā)生率為10%，經(jīng)過處理可得到約1～10×10^4個凋亡細胞，應(yīng)該足以獲得清晰的凋亡DNA ladder。反之如果不能從＞3×10^6個細胞獲得清晰的凋亡DNA ladder，表明其中凋亡細胞少于1%。此時增加細胞用量也難已奏效。

4. 從組織塊提取凋亡DNA ladder。取10～20 mg組織塊放入小玻璃勻漿器，加100～200μl Extraction buffer，上下手動勻漿15～20次。取出勻漿液，冰上5～10 min。振蕩10秒。4500 rpm 10分鐘收集上清液并轉(zhuǎn)移到新1.5ml離心管，執(zhí)行提取步驟3。另外一種方法是將30～50mg組織剪碎后在PBS里面勻漿，制成細胞懸液，離心收集細胞后接步驟2繼續(xù)執(zhí)行提取。

5. 采用高質(zhì)量瓊脂糖，使用寬度較小和厚度較窄的樣品梳子，制作較薄的瓊脂糖凝膠(厚度約2～4 mm)；用較低的電壓進行慢速電泳，將顯著增加凋亡DNA條帶檢測靈敏度。電泳距離不要太長，否則將使小的凋亡DNA條帶彌散而降低分辨率。
本制品別名：細胞凋亡DNA Ladder分提試劑盒|組織凋亡DNA Ladder提取試劑盒

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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