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產(chǎn)品屬性：

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
石蠟包埋組織DNA提取試劑盒	FFPE DNA extraction kit	30次	CS-01F99027

介紹

本試劑盒是專門用于從甲醛和非甲醛固定的石蠟包埋組織中快提基因組DNA的試劑。石蠟包埋組織本是珍貴的分子生物學(xué)研究材料，但是由于它們的保存時(shí)間一般都比較長，很不容易從中提取到高質(zhì)量的DNA，存在的主要問題是DNA的斷裂和脫蠟過程中樣品的丟失。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.一管式操作，避免了可能的交叉污染和樣品DNA的丟失。

2.含一步離心式脫蠟試劑，不需要使用有毒的二甲苯，健康環(huán)保。

3. 得到的提取物可以直接用于PCR反應(yīng)。

4. 得到的DNA的OD260/280一般在1.6左右，長度在0.4-25 Kb 之間，可以直接作為PCR 模板。

5. 即開即用，客戶自己不需要準(zhǔn)備額外的試劑。

儲存條件：常溫運(yùn)輸及保存(溶液C需要-20℃保存)，有效期一年。

使用方法：

1. 將一片常規(guī)的石蠟包埋組織切片轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管(最好使用螺旋蓋離心管)中并加入1mL溶液A，在振蕩器上以最大速度振蕩10秒。

2. 加入75μl溶液B，在振蕩器上以最大速度振蕩10秒。

3. 7000g室溫離心2分鐘，溶液將形成兩個(gè)相，其中組織切片位于下相。

4.小心吸棄上層液體。

5. 將離心管放入真空離心機(jī)中，7000g離心，抽干下層的液體，一般需要一小時(shí)。

6. 加入150μL溶液C，55℃保溫過夜。

7. 7000g 短暫離心，95℃保溫10分鐘。

8. 7000g室溫離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中待用。

9. PCR 檢測時(shí)，一般在50μl PCR體系中加入1-5μL的模板DNA。
注意:很多時(shí)候樣品中會有未明的PCR 抑制物，多加模板反而會抑制PCR反應(yīng)。加入的PCR抑制物清除劑(BTN60804)可能會有幫助。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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