產(chǎn)品目錄

1. 每例患者在常規(guī)痰標本采樣時，最好連續(xù)三天采集三次樣品以防誤差。具體做法是先在每個50mL的痰液收集管內(nèi)新鮮加入10mL溶液A和10mL溶液B，待患者晨起漱口后，咳深部痰7～8口(約10-20mL)，收集到裝有溶液A和溶液B混合液的痰液管收集內(nèi)，混勻后儲于4℃冰箱或陰涼處。第二、三天重復(fù)此操作。取足三管后一起送實驗室，4℃冰箱保存直到使用。

2. 使用時，在室溫反復(fù)振搖裝有樣品(總體積約30-40mL)的痰液收集管5～10分鐘，充分混勻直到痰液中無粘稠痰塊而呈均勻的液相。

3. 4℃2500g離心5分鐘，棄上清。

4.沉淀再用自備的PBS液洗兩遍。

5. 所得沉淀可以直接用于涂片，用于比較細胞形態(tài)學分析。也可以將細胞沉淀在0.2mL PBS緩沖液中重懸后轉(zhuǎn)入1.5mL螺旋蓋塑料離心管，-20℃冰箱長期保存，或立即用于下步的DNA提取。為避免蓋子崩開而出現(xiàn)交叉污染或痰液的分枝桿菌污染環(huán)境，建議不要使用壓蓋式塑料離心管。同時最好設(shè)置一個陽性和一個陰性對照。

二：DNA提取

6.在上步所得的0.2mL樣品中加入0.6mL溶液C。溶液C容易形成沉淀，用前需37℃加熱融化并搖晃均勻。

7.室溫放置10分鐘。此間可以在每個管外壁上做個標記，以在下步區(qū)別向心面和離心面。

8. 振蕩數(shù)秒后加入0.7mL自備的異丙醇，旋緊蓋后振蕩30秒混勻。

9. 把離心管的向心面對向轉(zhuǎn)頭，13,000-15000g室溫離心至少15分鐘。

10.小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的DNA沉淀(此時可能看不見)。

11. 加入1.0mL 70%乙醇，振蕩數(shù)秒后 15000g室溫離心5分鐘。注意：在離心機中放置離心管時將其向心面對向轉(zhuǎn)頭的中央。

12.小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的DNA沉淀(此時呈膜狀沉淀)。

13. 將離心管放回離心機再短暫離心數(shù)秒，然后用移液器移棄約50μL殘留液體(70%乙醇)，否則它會影響后續(xù)反應(yīng)。

14. 加入200μl RNase-free水，用移液槍仔細吹打離心管管底和管壁離心面的膜狀DNA沉淀，溶液將呈混濁狀，含少量不溶，短暫離心后存上清(含DNA)。
15. 直接取適量用于PCR，樣品使用量不超過PCR體系的1/2。剩余DNA樣品可以室溫放置2小時，也可保存于-80℃保存一個月。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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