產(chǎn)品目錄

b)對(duì)懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，在每1-5×106懸浮細(xì)胞中加入0.8mL預(yù)熱的溶液A，用槍充分吹打以確保細(xì)胞全部裂解。然后把裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中。如果是fibroblasts或carcinoma細(xì)胞，0.8mL溶液A的細(xì)胞使用量不要超過1×106個(gè)細(xì)胞。

c)對(duì)新鮮或冷凍的組織：先將剪切成小塊的新鮮組織或冷凍保存的組織放入10mL或15mL塑料離心管中，每50-100mg組織加0.8mL預(yù)熱的溶液A，用剪切式勻漿器勻漿30秒左右，然后把裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中。對(duì)肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織(細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的DNA)，建議組織的使用量不要超過50mg。

d)對(duì)DNAhold保存組織：先用紙吸去DNAhold液體后再剪切成小塊，其余操作同新鮮或冷凍組織的處理。

2. 加入0.4mL預(yù)熱的溶液B到裂解液中。由于溶液B十分粘稠，可將1mL槍頭剪掉一截再用，也可以用稱量方法加0.4 g。加入溶液B后需要顛倒數(shù)次充分混勻。

3. 65℃水浴5-10分鐘。如果室溫放置，DNA產(chǎn)量將降低10-20%。

4. 加入0.2mL自備氯仿，振蕩器上充分振蕩混均30秒，此時(shí)溶液將呈乳白色。一定要確保離心管底的液體被震蕩起來(lái)。

5. 12000～15000g室溫離心2分鐘。上清透明，中間層為白膜(蛋白層)。

6.小心將上清液平均轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新的離心管中，避免觸及中間的白膜。

7. 每個(gè)管中加入1.5倍體積的溶液C，充分顛倒混勻。

8. 分兩次上柱(即先轉(zhuǎn)移一半的混合液到離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000～15000g室溫離心半分鐘，棄穿透液，然后再將剩下的混合液到離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000～15000g室溫離心半分鐘，棄穿透液)。

9. 加0.7mL通用洗柱液到離心吸附柱中，12000～15000g室溫離心半分鐘，棄穿透液。

10. 加0.3mL通用洗柱液到離心吸附柱中，12000～15000g室溫離心半分鐘，棄穿透液。

11. 12000～15000g室溫再離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的通用洗柱液會(huì)污染DNA。

12.室溫放置半分鐘使殘留乙醇揮發(fā)。

13. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一新的1.5mL塑料離心管中，加入50-100μL DNA洗脫液2.0，室溫放置離心吸附柱1-2分鐘。
14. 12000～15000g室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為DNA樣品，可以立即使用或存放于冰箱待用。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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