產(chǎn)品目錄

血液DNA是重要的研究材料，但是血液DNA在常溫下存放的時(shí)間很短，因此很多血液樣品都是凍凝存放。由于凍存過程中形成的冰晶會(huì)刺破細(xì)胞膜，釋放出DNA，因此從凍存血液中高效提取DNA一直是個(gè)棘手的問題。本產(chǎn)品就是北京我公司開發(fā)的專門用于從凍存血液中提取DNA的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.適用于各種動(dòng)物血液，包括禽類和昆蟲。

2. 微量提取，每次可處理400μL 血液。

3. DNA 完整性好，純化后長(zhǎng)度在20-50 Kb 之間。

4. DNA 純凈，OD260/OD280在1.8-2.0 之間，可直接用于PCR、酶切、雜交等實(shí)驗(yàn)。DNA產(chǎn)量一般在10μg/mL 血液。

5. 操作簡(jiǎn)單，整個(gè)過程約20分鐘，室溫操作，適合大規(guī)模樣品處理。

儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸和保存，有效期一年。

使用方法：

1.從-20℃或更低的冰箱中取出血液樣品，室溫下靜置融化。

2. 將400μL 解凍的血液轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5mL的塑料離心管中，加入400μL溶液A，充分震蕩混勻。如果是禽類血液，則少加10倍，只加40μL。

3.在混合液中加入400μL溶液B和200μL 氯仿(自備)，振蕩1分鐘。由于離心管比較滿，所以需要確保管底溶液轉(zhuǎn)動(dòng)起來，否則只是液面振動(dòng)而已。

4. 4℃12000 g離心10分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL塑料離心管

中。注意：最好不要室溫離心，如果室溫離心，則離心后部分樣品的中間白色層可能會(huì)很厚，只能得到很少的上清。

5. 將約0.7-0.8mL上清轉(zhuǎn)移到10-15mL塑料離心管中(不要使用玻璃離心管，否則DNA 會(huì)吸附到管壁上。常用的培養(yǎng)提質(zhì)粒用的細(xì)菌的培養(yǎng)管即可)。

6. 加入2.5倍上清體積的溶液C(2mL)，立即搖晃混勻。

7. 將混合液分多次轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，每次0.7mL左右，轉(zhuǎn)移后靜置2-5分鐘，以使DNA與膜充分結(jié)合，然后室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液，然后再加入0.7mL，重復(fù)上述操作，直到全部混合液掛柱。

8.在離心吸附柱中加入0.7mL 通用洗柱液，室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液。

9.在離心吸附柱中再加入0.3mL 通用洗柱液，室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液。

10.室溫12000 g離心30秒，去盡殘留液體(此步驟十分重要，不要省略，否則殘留的含乙醇的通用洗柱液將抑制后續(xù)的酶反應(yīng))。

11. 將離心吸附柱置于一新的1.5mL塑料離心管中，加入50μL DNA 洗脫液2.0，室溫放置2分鐘。如果將DNA 洗脫液2.0在65℃預(yù)熱后再使用，洗脫DNA的效果更佳。

12.室溫12000 g離心30秒，離心管底部溶液即DNA溶液，可立即使用或-20℃長(zhǎng)期保存。
13. 本產(chǎn)品所用離心吸附柱吸附能力比較強(qiáng)，如果再次用DNA 洗脫液2.0洗脫，還能洗脫下一些血液DNA。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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