產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
海洋動物DNA提取試劑盒(柱式提取)	Marine animal DNA column extraction kit	50次	CS-01F99020

本試劑盒是在柱式動物DNA提取試劑盒(BTN71206)試劑盒基礎(chǔ)上優(yōu)化改良而得，專門針對海洋動物的基因組DNA提取的試劑盒，可用于魚類、蝦類、貝類、蟹類等海洋動物和水產(chǎn)動物的荃因組DNA提取，可以有效去除海洋動物組織中的蛋白、脂肪及其他有機化合物等雜質(zhì)。

產(chǎn)品特點：

1.使用本試劑盒提取的基因組DNA可適用于各種常規(guī)分子生物學(xué)操作，如:酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等試驗。

2.操作簡單安全，1小時內(nèi)即可獲得超純的基因組DNA，純化過程中不需要使用苯酚氯仿等有機試劑。

3.應(yīng)用廣泛，適用于多種動物細胞和動物組織等。

4.性價比高，質(zhì)量和國外同類試劑盒相當，價格更低。

儲存條件：常溫運輸及保存(蛋白酶K溶液需要低溫運輸，-20℃保存)，有效期一年。

使用方法：

使用前請先在溶液C和通用洗柱液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。

1.切取不多于30mg的組織材料，放入裝有200μL溶液A的離心管中，渦旋振蕩15秒。注意：根據(jù)提取的組織不同，起始量也稍有不同，腮的細胞量較大，一般建議提取量不超過20mg。如果需要去除RNA，可加入40μL RNase A(10mg/mL)溶液(客戶自備，BTN3160)，振蕩15秒，室溫放置5分鐘。

2.加入20μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，渦旋混勻，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。在56℃下放置，直至組織完全溶解，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進行下一步驟。注意：不同組織裂解時間不同，通常需0.5～2小時即可完成。扇貝組織0.5小時基本可裂解完全，蝦和魚類組織1小時。每小時振蕩混合樣品2～3次，每次振蕩混勻15秒。

3.加入200μL溶液B，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。注意：加入溶液B時可能會產(chǎn)生白色沉淀，一般70℃放置時會消失，不會影響后續(xù)實驗。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的DNA不純。

4.加入200μL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

5.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個離心吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。

6.向離心吸附柱中加入500μL溶液C(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm(～13400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

7.向吸附柱中加入600μL通用洗柱液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm(～13400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

8.重復(fù)操作步驟7。

9.將吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400×g)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實驗。
10.將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200μL通用洗脫液，室溫放置2～5分鐘，12000rpm(～13400×g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。注意：通用洗脫液的體積不應(yīng)少于50μL，體積過小影響回收效率。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm(～13400×g)離心2分鐘。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用超純水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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