產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
柱式植物葉綠體DNA提取試劑盒	Plant Chloroplast DNA column extraction kit	15次	CS-01F99003

介紹本產(chǎn)品是結(jié)合植物葉綠體純化試劑盒和柱式植物DNA抽提試劑盒而推出的試劑盒，專門用于植物葉綠體DNA的快速提取。

產(chǎn)品特點：

純度高，不含污染和抑制劑，可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting,microsatellite analysis等各種后續(xù)分子生物學實驗，不會發(fā)生離心柱堵塞現(xiàn)象。

產(chǎn)率一般在1～2μg/1g葉片樣品。OD260/280一般在1.8以上。DNA片段長度一般在40～50 Kb左右。

本產(chǎn)品足夠15次提取，每次可處理30g葉片。

已經(jīng)成功用于菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等雙子葉植物，也適用于單子葉等其他植物（可能需要優(yōu)化條件）。

保存：RT，其中勻漿液成分二需4℃保存，有效期1年。

自備器材：

去離子水、氯仿、Waring勻漿機、燒杯、量筒。

使用方法：

注意：葉綠體對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或者在冷室進行，所用器皿和溶液均需要在4℃預(yù)冷。離心時一定要在4℃進行，離心力以g而不是rpm計算。如果需要研究葉綠體的功能，提取還需要在昏暗的光線條件下進行。強烈建議用顯微鏡監(jiān)控整個過程中葉綠體的回收情況。

一、葉綠體的純化

實驗前1～2天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實驗前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片的放置時間也不能超過一天。

計算實驗所需勻漿液的體積。本試劑盒一次實驗可處理30g葉片，對一般植物，每克葉片需要準備4mL勻漿液，則一次實驗需要準備120mL勻漿液。對煙草和大豆，每克葉片需要6mL勻漿液，則一次實驗需要準備180mL勻漿液。為了保險最好可以多配10%。

實驗當天制備勻漿液。制備方法是：將自備的去離子水與葉綠體純化勻漿液成分一在干凈的玻璃或塑料容器中按4：1的比例混合，然后在每100mL混合液中加入勻漿液成分二干粉0.1g（終濃度為0.1%），輕柔攪拌10分鐘后，所得溶液即為勻漿液。冰上預(yù)冷待用。勻漿液只能當天使用，不能放置。

預(yù)留1.5mL勻漿液用于懸浮葉綠體，其余勻漿液轉(zhuǎn)移到Waring勻漿機（即家用制備果汁的勻漿機）中，再快速將新鮮植物葉片的葉脈去除，再將葉片剪成1-3cm2大小的碎片，浸泡在勻漿機里面的勻漿液中。

低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的葉碎片按入到勻漿機底部，再低速勻漿10秒。注意：理論上可用Dounce玻璃勻漿器，Polytron勻漿機和研磨（加玻璃珠）等勻漿，但它們單次處理量小，需分成很多份處理后再匯集，非常不方便。

用試劑盒提供的帶柄尼龍濾篩過濾勻漿液，用預(yù)冷的200mL量筒收集穿透液，再等分到4個預(yù)冷的50mL的塑料離心管中（每個管中的穿透液不要超過35mL）。帶柄尼龍濾篩洗滌干凈后可反復(fù)使用。

在水平轉(zhuǎn)子離心機上4℃ 200g離心3分鐘（對菠菜，白菜和萵筍材料）或400g離心1分鐘（對甜菜材料），白色沉淀為未破裂的細胞或細胞核。其他植物材料則需要用戶自己摸索最佳離心力。

將上清液（含葉綠體）轉(zhuǎn)移到一個新的、預(yù)冷的50mL塑料離心管中。

在水平轉(zhuǎn)子離心機上4℃ 1000g離心7分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體。

在沉淀中加入第4步預(yù)留的1.5mL預(yù)冷勻漿液，用軟毛筆使葉綠體重懸，如果有白色淀粉沉淀，重懸時避免重懸白色淀粉。

加入1.5倍體積(約1.2mL)的溶液C，顛倒混勻后先轉(zhuǎn)移0.7mL到離心吸附柱中，室溫放置至少2分鐘。12000rpm室溫離心1分鐘，DNA將吸附在離心吸附柱的膜上，倒棄收集管中的穿透液。

再將剩余的溶液按上步方法上柱。

將0.5mL通用洗柱液加入到吸附柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄穿透液。重復(fù)操作一次�？账Π敕昼娙コ龤埩粢后w。

將離心吸附柱放置在一新的1.5mL塑料離心管中，加50～100μL DNA洗脫液2.0，室溫放置3～5分鐘。
12000rpm室溫離心1分鐘即得植物葉綠體DNA溶液，直接取5～10μL電泳檢測，其余放冰箱備用。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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