產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(變性劑耐受)	His-tag Protein Purification Kit (Denaturant-resistant)	10mL	CS-01F98995

本試劑盒是一種采用了新型的GoldBalb His-tag Purification Resin (變性劑耐受型)的可以兼容高濃度變性劑(8M尿素或6M鹽酸胍)，并能簡單、快速、靈活、高效并且高特異性地在非變性或變性條件下純化His標(biāo)簽蛋白的試劑盒。

使用便捷，提供了空柱管和配套試劑。試劑盒提供了His標(biāo)簽蛋白所需的相關(guān)試劑和親和層析柱空柱管，為His標(biāo)簽蛋白的純化帶來了極大的便利。

用途廣泛，非變性和變性條件都可以使用。本試劑盒不僅可以用于在非變性條件純化His標(biāo)簽蛋白，也可用于在變性條件純化His標(biāo)簽蛋白。本試劑盒提供了非變性和變性條件下純化His標(biāo)簽蛋白所需的不同的裂解液、洗滌液和洗脫液，可以很好地滿足不同實(shí)驗(yàn)的需要。很多情況宜優(yōu)先選擇非變性條件進(jìn)行目的蛋白的裂解。如果發(fā)現(xiàn)非變性條件目的蛋白的裂解效果欠佳，但目的蛋白的表達(dá)量能達(dá)到預(yù)期時(shí)，先宜考慮調(diào)整目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件，例如調(diào)整IPTG等誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時(shí)的溫度等。如果調(diào)整誘導(dǎo)條件后在非變性條件下仍然裂解效果欠佳，此時(shí)宜考慮選擇變性條件進(jìn)行裂解、洗滌和洗脫。

變性條件溶解性好，洗脫樣品可以直接PAGE檢測。試劑盒配套提供的變性裂解液、變性洗脫液和變性洗滌液中均含有8M尿素，可以有效促使蛋白變性和溶解；終洗脫下來的目的蛋白無需透析即可用于PAGE檢測。終純化獲得的目的蛋白可以通過透析去除尿素后用于后續(xù)特定用途。
通常帶有6個(gè)組標(biāo)簽的重組蛋白或帶有6個(gè)以上連續(xù)組標(biāo)簽的重組蛋白，被稱為His標(biāo)簽蛋白。蛋白樣品溶液通過GoldBalb His-tag Purification Resin (變性劑耐受型)時(shí)，重組蛋白His標(biāo)簽上的組殘基能特異性地結(jié)合到GoldBalb His-tag Purification Resin (變性劑耐受型)中的鎳離子上，其它蛋白則不能被結(jié)合。洗滌后，His標(biāo)簽重組蛋白可在非變性條件下被洗脫，從而被分離純化。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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