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TEV Protease是一種在大抽桿菌中重組表達(dá)的帶His標(biāo)簽(6X His tag)的煙草蝕紋病毒(Tobacco Etch Virus,TEV)的半胱蛋白酶，能特異性地識(shí)別七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase(GST)、His或者其它標(biāo)簽的蛋白酶。

建議把GST或His等標(biāo)簽設(shè)計(jì)在融合蛋白的N端，并在GST或His等標(biāo)簽與目的蛋白之間設(shè)計(jì)加入TEV Protease專(zhuān)一性識(shí)別與酶切的上述七肽序列。這樣在GST或His標(biāo)簽被酶切后，在目的蛋白的N端僅有一個(gè)額外的Gly/Ser氨基酸殘基，從而大限度地減少了對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。構(gòu)建含有TEV Protease專(zhuān)一性識(shí)別位點(diǎn)的目的蛋白表達(dá)質(zhì)粒，可以考慮選購(gòu)的質(zhì)粒pET-N-His-TEV(YT976)。

TEV Protease的佳酶切溫度是30℃，在29～34℃范圍內(nèi)均具有較高的酶活性，但當(dāng)溫度達(dá)到或高于高37℃時(shí)，其酶活性會(huì)急劇下降。在實(shí)際操作過(guò)程中，為盡量保留目的蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性，建議在4℃用TEV Protease酶切過(guò)夜。TEV Protease在pH6.0～9.0范圍內(nèi)具有活性，而當(dāng)pH小于或等于5時(shí)，會(huì)失去酶活性。

TEV Protease還有一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)是在400mM咪唑中仍有較高活力，因此對(duì)于很多用鎳柱純化的His標(biāo)簽?zāi)康牡鞍?，可直接?/span>TEV Protease加入含高濃度咪唑的剛剛純化的目的蛋白溶液中，在4℃邊透析去除咪唑邊進(jìn)行酶切。當(dāng)然也可以在透析后再用TEV Protease進(jìn)行酶切以去除His標(biāo)簽。經(jīng)過(guò)酶切的目的蛋白，溶液中帶有His標(biāo)簽的本TEV Protease以及切除下來(lái)的His標(biāo)簽，都可以通過(guò)與鎳柱結(jié)合而去除。His標(biāo)簽蛋白的純化可以考慮選購(gòu)我司的His標(biāo)簽蛋白純化樹(shù)脂或His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，以及His標(biāo)簽純化樹(shù)脂(變性劑耐受型，貨號(hào)：YTB4204)或His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(變性劑耐受型，貨號(hào)：YTB046)。
TEV Protease的酶活性不會(huì)被常見(jiàn)的絲蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor)如PMSF、AEBSF、bestatin、pepstatin、E-64、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱(Cysteine)殘基的蛋白酶抑制劑如NEM或IAA等，可以顯著抑制TEV Protease的酶活力，因?yàn)樘烊坏?/span>TEV Protease含有其維持酶活力所必需的Cys151。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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