產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
His標簽蛋白純化樹脂(變性劑耐受型)	GoldBalb His-tag Purification Resin (Denaturant-resistant)	10ml\|100ml\|10×100ml	CS-01F98963

本產(chǎn)品是一種新型的可以兼容尿素和鹽酸胍等蛋白變性劑，從而不僅可以在非變性條件下也可以在變性條件下簡單、快速、高效并且高特異性地純化His標簽蛋白的純化介質(zhì)。

通常帶有6個組標簽的重組蛋白(6×His-tagged recombinant protein)或帶有6個以上連續(xù)組標簽的重組蛋白，被稱為His標簽蛋白。蛋白樣品溶液通過GoldBalb His-tag Purification Resin (變性劑耐受型)時，重組蛋白His標簽上的組殘基能特異性地結(jié)合到GoldBalb His-tag Purification Resin (變性劑耐受型)中的鎳離子上，其它蛋白則不能被結(jié)合。洗滌后，His標簽重組蛋白可在非變性條件下或者變性條件下被洗脫，從而被分離純化。

本產(chǎn)品對His標簽重組蛋白的親和力、選擇性高、結(jié)合容量大，使用本產(chǎn)品可以獲得高純度的His標簽重組蛋白，可用于簡單、快速、高效地純化細菌、哺乳動物細胞、昆蟲及桿狀病毒等多種表達系統(tǒng)中表達的His標簽重組蛋白。純化的蛋白可以用于結(jié)構(gòu)和功能研究、抗體制備、蛋白與蛋白相互作用、蛋白與核酸相互作用等方面的研究。

本產(chǎn)品采用了一種高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠(Sepharose CL-6B)為基質(zhì)，并使用了進一步優(yōu)化的接臂和鎳離子螯合技術(shù)，和目前市售的同類產(chǎn)品相比，非特異性蛋白結(jié)合顯著降低。

本產(chǎn)品可以耐受8M尿素或6M鹽酸胍，可用于非變形條件和變性條件下His標簽蛋白的純化。DTT、-巰基乙醇等還原劑會還原螯合結(jié)合的鎳離子，而EDTA/EGTA等二價離子螯合劑則會使本產(chǎn)品脫鎳，因此在蛋白樣品或者純化過程所使用的溶液中不能含有還原劑和螯合劑。如需在還原劑如DTT/-巰基乙醇或螯合劑EDTA/EGTA存在的條件下純化蛋白，推薦使用的耐受還原劑和螯合劑的YT616 GoldBalb His-tag Purification Resin (耐還原螯合型)。

本產(chǎn)品已經(jīng)螯合了鎳離子，呈藍綠色，凝膠的顆粒直徑為45～165μm。可耐受的大壓力為0.025MPa，約合5.8psi。采用固定流速進行蛋白純化時的推薦流速為0.5mL/min。

本產(chǎn)品可以高容量、高特異性地結(jié)合His標簽蛋白。大蛋白結(jié)合量約為25～35mg蛋白(分子量為55kD的蛋白)/mL凝膠。實際使用時的大結(jié)合量主要取決于待純化的His標簽重組蛋白的分子量大小，分子量越大則大結(jié)合容量越大，分子量越小則大結(jié)合容量越小。但對于分子量相同的蛋白，也會因為蛋白本身特性的不同，結(jié)合的大容量也會有所不同。

本產(chǎn)品儲存在20%乙醇中。本產(chǎn)品包裝體積中50%為凝膠，例如10mL總體積中5mL為凝膠，5mL為液體。使用時宜把凝膠充分重懸后再吸取。
每10mL包裝的本產(chǎn)品多可純化100～200mg帶有His標簽的重組蛋白(分子量為55kD的蛋白)，分子量更大的蛋白結(jié)合容量會更大一些。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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