產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
三色預(yù)染蛋白Marker(5～245kDa)	RealColor three-color Protein Marker(5-245kDa)	100μl\|250μl\|1mL	CS-01F98948

本產(chǎn)品是一種即用型的三色蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，含有13種預(yù)染色蛋白質(zhì)，在Tris-Glycine緩沖液中覆蓋從5至245kDa分子量的各種分子量的（在Bis-Tris (MOPS)緩沖液和Bis-Tris(MES)緩沖液中為3.5～235kDa）。蛋白質(zhì)與不同的發(fā)色團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)以便于鑒定條帶，在SDS-PAGE（Tris-Glycine緩沖液）上分離時(shí)，兩種參照蛋白分別攜帶對(duì)應(yīng)于25kDa的綠色和75kDa的紅色的增度條帶。

產(chǎn)品應(yīng)用：

本產(chǎn)品可用于監(jiān)測(cè)SDS-PAGE過(guò)程中的蛋白質(zhì)的分離，驗(yàn)證Western膜轉(zhuǎn)移效率(PVDF膜，NC膜)和蛋白質(zhì)分子量確定。

保存：-20℃，有效期2年。

緩沖溶液：

20mM Tris-磷酸鹽(pH7.5@25℃)，2% SDS，0.2mM二硫蘇糖醇，3.6M尿素和15%（v/v）甘油。

質(zhì)量控制：

15% SDS-PAGE（Bis-Tris gel，MES buffer）中形成13條蛋白條帶，經(jīng)Western blot轉(zhuǎn)到NC膜上。

注意事項(xiàng)：

本蛋白Marker保存在上樣緩沖液中，可直接使用。上樣前不要加熱，稀釋或添加其他還原劑。
每種蛋白質(zhì)的表觀分子量（kDa）已經(jīng)根據(jù)未預(yù)染的蛋白marker校準(zhǔn)過(guò)，但在不同電泳條件下應(yīng)考慮補(bǔ)充數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)整。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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