產(chǎn)品目錄

本試劑盒提供了配制Tricine-SDS-PAGE凝膠所需的各種試劑，用戶只需自備制膠器具和蒸餾水，即可配制Tricine-SDS-PAGE膠。Tricine-SDS-PAGE膠可分離常規(guī)SDS-PAGE不易分離的小于10 KD的蛋白及多肽，與市面在售Tricine膠相比，有電泳時間短，凝膠快等特點。本試劑盒約可配制50塊常規(guī)大小的PAGE膠。

保存事項：

Gel Buffer和APS室溫保存。49.5%T 3%C、49.5%T 6%C和TEMED 4℃避光保存。APS配制成10%溶液(0.5g APS加5mL純水)后，分裝成小管-20℃保存，通常半年內(nèi)有效。

注意事項：

APS配制成10%溶液后，應當-20℃保存。同時應盡量減少室溫存放時間，以防失效。

TEMED易揮發(fā)，使用后請蓋緊瓶蓋。另外凝膠凝聚的速度和溫度及光照關(guān)系密切，可通過適當調(diào)節(jié)TEMED的用量，控制在不同的室內(nèi)環(huán)境下凝膠凝聚的速度，配置膠時TEMED后加入。

產(chǎn)品中的保存條件及有效期均以未開封情況下計算，為了防止產(chǎn)品與空氣接觸發(fā)生化學反應影響產(chǎn)品性能，將未使用完畢的組分按存儲要求保存同時建議開封后的組分盡快使用完畢。

建議水壓時，緩慢加入水珠，速度過快會使分離膠上層濃度不均，影響后續(xù)染色照相。

建議在4℃環(huán)境或常溫冰浴下進行電泳實驗，防止電流過大，造成溫度升高，燒膠等現(xiàn)象。
TEMED易燃，有腐蝕性，請注意防護。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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