產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
Ni-NTA預(yù)裝色譜柱	Ni-NTA Prepacked chromatographic column	1X1mL\|1X5mL\|5X1mL\|5X5mL	CS-01F98925

概述

該介質(zhì)的基質(zhì)為90μm的高度交聯(lián)瓊脂糖，金屬離子螯合配基經(jīng)共價(jià)連接具有良好的穩(wěn)定性。螯合配基帶有二價(jià)的Ni2+，是純化多數(shù)組標(biāo)簽蛋白的選介質(zhì)。該介質(zhì)的配基密度經(jīng)過優(yōu)化從而保證了高蛋白結(jié)合載量和高選擇性，而高流速特性使得該介質(zhì)適合于大規(guī)模純化。

儲(chǔ)存條件：冷藏（2-8℃）不可凍存

特點(diǎn)

與三價(jià)金屬離子螯合劑亞氨基二乙酸制成的Ni-IDA-瓊脂糖相比，Ni-NTA-瓊脂糖的非特異性吸附明顯減少，可讓使用者獲得更高純度的目標(biāo)蛋白；支持變性包涵體蛋白的柱上復(fù)性，起到分離、復(fù)性同步進(jìn)行的效果；可耐受溶液中更高濃度的還原試劑（β-巰基乙醇高可用到20mM）；瓊脂糖基質(zhì)在pH 3~12范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，可以耐受反復(fù)在位清洗（CIP）；5.純化過程中極少的Ni2+滲漏；6.可以反復(fù)使用和再生5~10次。

應(yīng)用

用于各種表達(dá)來源（如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）的組標(biāo)簽蛋白的純化

使用說明

可以用各種常規(guī)的中壓色譜系統(tǒng)，如AKTA儀器

適用樣本
適配各類中壓色譜系統(tǒng)，如AKTA等

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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