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DSP是不溶于水的同型雙功能的N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS-酯）。DTSSP是其水溶性類似物。這些交聯(lián)劑是硫醇可裂解的，與伯胺反應(yīng)的并且已經(jīng)用于很多應(yīng)用中。NHS-酯能夠與伯氨基（-NH2）有效反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，釋放N-羥基琥珀酰亞胺。DSP是非磺化的，因此是疏水性的，而DTSSP是磺化的和水溶性的。需要將DSP先溶解在有機(jī)溶劑中再加入到水相反應(yīng)混合物中。因?yàn)?/span>DSP沒有具有帶電荷的基團(tuán)，所有是親脂性和可滲透膜的，能夠用于細(xì)胞內(nèi)和膜內(nèi)蛋白質(zhì)的共軛反應(yīng)。DTSSP則可以直接添加到水相中，用于交聯(lián)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。

基本信息：

分子量：404.42

間隔臂：12Å

化學(xué)式：C14H16O8N2S2

保存：-20℃

使用方法：

一、在溶液中交聯(lián)蛋白的方法

所需材料

交聯(lián)劑溶液：將DSP溶于無水DMSO中，10～25mM。DTSSP可溶于水，緩沖液或直接加入樣品?；蛟?/span>pH5.0，5mM檸檬酸鈉緩沖液中制備DTSSP，并逐滴加入到反應(yīng)混合物中。丟棄任何未使用的重構(gòu)交聯(lián)劑。

反應(yīng)緩沖液：磷酸鹽緩沖液，HEPES，pH7～9的碳酸氫鹽/碳酸鹽或硼酸鹽緩沖液。避免含有伯胺的緩沖液，因?yàn)榘穼⑴c交聯(lián)反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。

步驟：

用反應(yīng)緩沖液配制蛋白質(zhì)溶液。如果樣品溶液含有Tris或甘，則需在反應(yīng)緩沖液進(jìn)行深度透析。

向蛋白質(zhì)樣品中加入所需的交聯(lián)劑。如果蛋白質(zhì)濃度大于5mg/ml，則使用10倍摩爾過量的交聯(lián)劑。若樣品小于5mg/ml，使用20～50倍摩爾過量的交聯(lián)劑。建議使用的交聯(lián)劑終濃度為0.25～5mM。

將反應(yīng)混合物在室溫下孵育30分鐘或在冰上孵育2小時(shí)。
加入20～50mM的胺溶液（如Tris或甘）淬滅反應(yīng)，孵育15分鐘。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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