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產(chǎn)品屬性：

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
超低分子量蛋白Marker(3.3～20.1kDa)	Protein Marker(3.3kD-20.1kD)	15T	CS-01F98648

本產(chǎn)品包含3種多肽和2種低分子量蛋白質(zhì)組成，分子量范圍為3.3kD～20.1kD?？梢杂脕?lái)判斷SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。本品為蛋白質(zhì)和多肽混合物的凍干粉，每種蛋白含量約為15～22.5μg，配有一支1×上樣緩沖液。

凝膠制備及染色注意事項(xiàng)：

1．先配制分離膠，聚合后再配制夾層膠，后配制濃縮膠，3種膠的制膠體積比為4:1.5:1。電泳時(shí)，30v跑1～2小時(shí)后，待指示前沿到達(dá)分離膠上沿時(shí)，把電壓調(diào)至100v，至電泳結(jié)束，整個(gè)電泳過(guò)程大約需要6～8小時(shí)。

2．由于多肽所含的氨基酸數(shù)目較少，因此如該多肽含有過(guò)多的極性氨基酸(堿性或酸性)，則會(huì)影響其在SDS-PAGE圖上的條帶遷移率，即其表觀分子量可能和多肽的氨基酸理論推算分子量有一定距離。

3．由于SDS-PAGE的圖譜上，蛋白質(zhì)對(duì)數(shù)分子量和遷移率成正比直線關(guān)系的分子量范圍為15,000～200,000，因此對(duì)于分子量小于10000的蛋白質(zhì)或多肽的分子量，只能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行估計(jì)，推斷其是否落入預(yù)測(cè)的分子量范圍。

4．由于低分子量多肽（3000及3000以下），極易從凝膠上浸出，因此染色及脫色時(shí)間不宜太長(zhǎng)，脫色后凝膠也不宜在水中浸泡保存過(guò)久，否則條帶會(huì)消失。

5．電泳之后可將膠置于固定液中固定20分鐘，再進(jìn)行染色，能得到較好的蛋白條帶；如時(shí)間不允許，也可不進(jìn)行固定直接染色。如果使用配方7進(jìn)行染色時(shí)效果不好或考慮其毒性，請(qǐng)選擇本公司的考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液，該產(chǎn)品具有染色快，無(wú)毒，靈敏性高等特點(diǎn)，是常規(guī)染色液的替代品。
儲(chǔ)存條件：-20℃保存，有效期為一年。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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