產(chǎn)品目錄

使用本產(chǎn)品可以對(duì)同一張膜進(jìn)行多次Western Blot檢測。在室溫條件下，將用過的膜浸泡在抗體去除液中30-60分鐘，可在不影響抗原蛋白的情況下清除膜上結(jié)合的抗體。隨后，可以使用不同的抗體進(jìn)行下一輪Western Blot實(shí)驗(yàn)，因而可利用同一張膜進(jìn)行多次蛋白檢測。適宜從少量樣品多次檢測多種不同蛋白質(zhì)。采用這方法多次檢測同一張膜上的蛋白，能省去蛋白電泳和膜轉(zhuǎn)移等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的步驟。

儲(chǔ)存條件：室溫保存

有效期：一年

注意事項(xiàng)：

1．有許多因素影響抗體從膜洗脫，如膜類型、抗體類型和濃度及其與抗原結(jié)合特性。因此需要優(yōu)化抗體去除液中孵育膜的時(shí)間。

2．確定膜上抗體是否去除與優(yōu)化抗體去除液孵育膜的時(shí)間：用ECL 工作液孵育再生后的膜約1分鐘，然后進(jìn)行X 光膠片曝光并顯影，可確定膜上的抗體是否完全去除。如膠片上顯示條帶，表明抗體未完全去除，應(yīng)繼續(xù)將膜浸泡在抗體去除液中另外孵育30-60分鐘。然后再次ECL檢查膜上抗體是否去除。重復(fù)此步驟直到抗體完全去除并確定佳孵育時(shí)間。

3．使用脫脂奶粉封閉的膜要比使用BSA 封閉的膜上的抗體更容易被去除下來。因此準(zhǔn)備進(jìn)行再生的膜，應(yīng)該使用脫脂奶粉而不是BSA 封閉。

4．盡量避免使用干燥保存的膜，干的膜上的抗體很難被去除干凈。

5．PVDF膜上使用的效果好于硝酸纖維素膜。

6．使用非化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的Western檢測，例如DAB，NBT/BCIP，不適用于本試劑。

用途：

清除硝酸纖維素膜或PVDF膜上結(jié)合的抗體，不影響抗原蛋白。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 節(jié)省樣品，一份樣品經(jīng)一次轉(zhuǎn)膜后多次印跡，得到更多數(shù)據(jù)。

● 溫和配方，在不損傷蛋白的基礎(chǔ)上，剝離一抗和二抗。
● 高效洗脫，背景低。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

在線咨詢

留言注意事項(xiàng)：

1.遵守中華人民共和國有關(guān)法律、法規(guī)，尊重網(wǎng)上道德，承擔(dān)一切因您的行為而直接或間接引起的法律責(zé)任。

2.請(qǐng)您真實(shí)的反映產(chǎn)品的情況,不要捏造、誣蔑、造謠。如對(duì)產(chǎn)品有任何疑問,也可以留言咨詢。

3.未經(jīng)本站同意，任何人不得利用本留言簿發(fā)布個(gè)人或團(tuán)體的具有廣告性質(zhì)的信息或類似言論。

您感興趣的產(chǎn)品*
您的單位*
聯(lián)系人*
聯(lián)系電話*
詳細(xì)地址*
常用郵箱*
請(qǐng)輸入您對(duì)我們的意見或建議*
驗(yàn)證碼*