產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱(chēng)	英文名稱(chēng)	規(guī)格	貨號(hào)
葉綠體蛋白提取試劑盒(蛋白組實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜適用)	Chloroplast protein extraction kit (proteomic test, mass spectrometry)	50T\|100T	CS-01F98436

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒用簡(jiǎn)便快速的方法即可從各種植物樣本中快速提取得到葉綠體總蛋白。適用于提取新鮮植物樣本，用于凍存樣本的提取時(shí)由于凍存過(guò)程中大部分葉綠體會(huì)被破壞，葉綠體蛋白回收率較低。

本試劑盒含有的獨(dú)特配方能夠有效溶解葉綠體膜組份。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對(duì)蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。

本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。

本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

本試劑盒的蛋白提取組份中不含有不可透析除去的去垢劑組份，不含SDS、Triton X-100、chaps等可能影響質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的組份，后得到的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)透析或者脫鹽處理后將不含有去垢劑、高濃度鹽等影響，基本可以滿(mǎn)足下游任意的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

本產(chǎn)品的蛋白酶抑制劑混合物中不含AEBSF，可以避免由于AEBSF導(dǎo)致的質(zhì)譜峰漂移，因此使用本產(chǎn)品提取的蛋白樣品可以用于質(zhì)譜(Mass Spectrometry,MS)檢測(cè)和分析，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)等相關(guān)研究。

本試劑盒采用非酶法提取，提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便，速度快，可在1小時(shí)內(nèi)完成，而且絕少交叉污染，但是蛋白回收率相比酶法較低。酶法提取制備的葉綠體總蛋白，回收率提高，蛋白純度高，保持天然活性，但是耗時(shí)較長(zhǎng)。如果需要更加快捷的提取試劑盒，可以選擇非酶法的提取試劑盒，對(duì)提取速度沒(méi)有要求的話(huà)，可以選擇酶法提取試劑盒（相關(guān)產(chǎn)品HR8059）。請(qǐng)根據(jù)實(shí)際需要選擇試劑盒。

保存事項(xiàng)：

蛋白提取液2～8℃保存；蛋白酶抑制劑-20℃保存。有效期1年。

注：

● 蛋白酶抑制劑未開(kāi)蓋使用前也可以2～8℃儲(chǔ)存。開(kāi)蓋使用后-20℃儲(chǔ)存。

● 蛋白酶抑制劑在2～8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

自備器材：
離心機(jī)，振蕩器，勻漿機(jī)/勻漿器●渦旋混勻器，PBS，蛋白定量試劑盒，100μm細(xì)胞篩

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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