產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
革蘭氏陽性菌蛋白提取試劑盒	Gram positive bacteria protein extraction kit	50T\|100T	CS-01F98385

革蘭氏陽性菌總蛋白提取試劑盒可以從各種革蘭氏陽性菌菌體中提取總蛋白，可用于純化蛋白的粗品制備及總蛋白制備。提取過程簡單方便。該試劑盒含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高質(zhì)量的蛋白提供了保證。

該試劑盒提取的蛋白具有天然活性，可用于報(bào)告基因檢測、SDS-PAGE電泳檢測、Western blotting、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、酶活分析等下游實(shí)驗(yàn)。每毫升菌液大概可以提得5-10mg蛋白。采用BCA或Lowry 法進(jìn)行蛋白定量。

本試劑盒提取的蛋白不可用于2D電泳。如下游實(shí)驗(yàn)需要用于2D電泳，請使用貨號HR0169的試劑盒。

儲(chǔ)存條件：蛋白酶抑制劑-20℃保存；蛋白穩(wěn)定劑-20℃保存；蛋白提取液室溫保存。

有效期：一年。

注意事項(xiàng)：

●本試劑盒僅供科學(xué)研究使用。

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開蓋時(shí)試劑損失。

● 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會(huì)影響使用效果。

● 好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并徹底清除殘留清潔劑。

● 避免皮膚或粘膜與試劑接觸。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1．使用方便：不需昂貴設(shè)備。

2．可以處理各種細(xì)菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3．將蛋白提取的時(shí)間縮短至 30分鐘-1小時(shí)。

4．采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5．含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

6．紫外檢測蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

7．蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。

該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲蛋白酶、半胱酸蛋白酶、天冬蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

8．本試劑盒中不有 EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 移液器、吸頭 ●離心機(jī)及離心管
● 渦旋振蕩器 ●冰箱，冰盒

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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