產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
熒光蛋白上樣緩沖液	Band-Now Pre-Staining Protein Sample Treatment Buffer for SDS-PAGE	100μl\|1ml\|2ml	CS-01F98269

熒光蛋白上樣緩沖液靈敏度高比銀染高。穩(wěn)定性，背景低?？蓪λ械鞍走M(jìn)行染色，不影響蛋白的遷移率與電泳圖譜。電泳過程中，游離的染料分子與溴酚藍(lán)的遷移速率一致，跑膠結(jié)束時(shí) 移至凝膠末端，背景干凈。熒光蛋白上樣緩沖液非常適合用于追蹤蛋白表達(dá)純化以及Western blot的SDS-PAGE。

熒光蛋白上樣緩沖液在電泳前的樣品處理階段對SDS-PAGE的蛋白樣品進(jìn)行預(yù)染，標(biāo)記上熒光。實(shí)驗(yàn)完成以后，凝膠中或轉(zhuǎn)膜后的蛋白條可直接通過紫外燈、LED燈或其他數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析，無需染色脫色。

使用步驟：

1. 請?jiān)谑褂们案鶕?jù)管壁標(biāo)簽上的體積加入resuspension buffer重懸。Resuspension buffer在4℃可能會有沉淀產(chǎn)生，室溫下放置至沉淀消失。

2. 將用上樣緩沖液處理的蛋白樣品與待電泳蛋白樣品1:2混合。比如，3ul上樣緩沖液+6ul蛋白樣品。

3. 90～100℃加熱上述處理的樣品混合液5分鐘。細(xì)胞或組織樣品，加熱時(shí)間延長至10分鐘。確保加熱溫度＞90℃使樣品充分受熱。

Ÿ 大部分預(yù)制膠(Bis-Tris體系除外)可以直接進(jìn)行下一步。Bis-Tris體系的預(yù)制膠(如Life Technology)，需加入20%已處理樣品體積的Enhancing buffer。比如，10ul已處理的樣品需加入2ul Enhancing buffer。

4. 樣品可以上樣進(jìn)行電泳了(無需再加Loading Buffer處理)。

5. 電泳結(jié)束后，將凝膠放至透射儀上進(jìn)行觀察和拍照。透射儀可以是紫外燈，藍(lán)光LED燈或其它凝膠成像系統(tǒng)。如果光源在可見光波長范疇的無需剝膠，因?yàn)榭梢姴ㄩL范圍內(nèi)的光可以穿透玻璃或塑料材質(zhì)的膠板。

6. (可選的)如果有需要，經(jīng)熒光蛋白上樣緩沖液處理的凝膠仍可進(jìn)行考染。按標(biāo)準(zhǔn)的考染步驟進(jìn)行即可。

注意事項(xiàng)：

1. 請勿使用該上樣緩沖液處理預(yù)染的或預(yù)處理的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。這些產(chǎn)品與熒光蛋白上樣緩沖液不兼容。

2. 靈敏度影響因素：高pH(大于7)不會影響染色，低pH則會降低染色的效率，如果樣品的pH低于5，建議將pH調(diào)整至7以上。

3. 熒光蛋白上樣緩沖液不適合在如下SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)中使用：切割蛋白條帶用以測序、質(zhì)譜分析或抗體制備。

4. 建議-20保存，如果室溫放置2-3周，則可添加新的DTT，蛋白條帶會重新變得清晰和明亮。添加DTT的終濃度不要過20mM。也可以添加其他還原劑TCEP(2 mM)，效果也很好。
儲存條件：-20℃

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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