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Caerulein 雨蛙肽（雨蛙素）是囊收縮素（CCK）的肽類類似物，已經(jīng)成功運(yùn)用于大鼠、小鼠、狗和敘利亞倉鼠等動(dòng)物急性炎（AP）模型的建立?？刹捎渺o脈注射、皮下注射或腹腔注射的途徑給藥，靜脈注射佳。建模機(jī)制在Caerulein 雨蛙肽（雨蛙素）能刺激，促使胰蛋白水解酶大量分泌，引起腺泡自溶。可通過嚴(yán)格控制注射劑量，注射頻率控制成模時(shí)間以及模型的嚴(yán)重程度。

Caerulein 雨蛙肽（雨蛙素）方法建立模型的優(yōu)勢(shì)在于相對(duì)簡(jiǎn)單，不需手術(shù)創(chuàng)傷小，成本較低，產(chǎn)生AP迅速，給藥方式多。適合用于研究急性炎（AP）的細(xì)胞生物學(xué)和病理生理特性以及研究全身性疾病表現(xiàn)。除了調(diào)研AP疾病的肺臟方面變化，還可有效闡明內(nèi)臟內(nèi)分泌相互作用如分泌活素和CCK水平。還可用來評(píng)估有毒物質(zhì)終止后受傷組織的愈合和修復(fù)情況。但該模型大的缺點(diǎn)在于盡管注射大劑量的Caerulein 雨蛙肽（雨蛙素）都只能產(chǎn)生輕微的炎，幾乎無死亡率。

現(xiàn)在也有很多研究者聯(lián)合使用Caerulein 雨蛙肽（雨蛙素）和LPS建立炎模型，在一定程度上彌補(bǔ)了單一使用Caerulein 雨蛙肽（雨蛙素）建模的缺陷。因?yàn)?/span>LPS作為一種內(nèi)毒素，可激活單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子從而啟動(dòng)全身性炎癥反應(yīng)。臨床上內(nèi)毒素水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Caerulein 雨蛙肽（雨蛙素）與LPS建立SAP模型的協(xié)同作用主要表現(xiàn)為：前者刺激胰液酶破壞胰臟，持續(xù)性激活炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子。隨后LPS破壞炎癥介質(zhì)的正常反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)展局部的炎為全身性的嚴(yán)重性炎癥反應(yīng)。

純度：≥97% (HPLC) (實(shí)際達(dá)到98%的含量)

分子式：C58H73N13O21S2

分子量：1351.5

CAS：17650-98-5

外觀: 白色粉末
序列: pGlu-Gln-Asp-Tyr(SO3H)-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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