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重組型TEV蛋白酶（rTEV）是經(jīng)過基因工程改造和純化后的重組蛋白酶，不僅保持天然TEV酶的功能活性，且在廣譜的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性和特異性。rTEV是一種用來切除融合蛋白上親和標簽的常用工具酶，具有很的位點特異性，嚴格識別七氨基酸序列EXXYXQ↓(G/S)，切割位點在和甘/絲之間。普遍應(yīng)用的七氨基酸序列為：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly。rTEV在pH7.0，30℃時可達到佳活性，但在pH6.0-8.5和溫度4-30℃的廣泛范圍內(nèi)皆有活性（見表1），使得反應(yīng)條件的選擇可根據(jù)目的蛋白的情況而靈活變動。另外rTEV切割后也能利用其N端的6×His標簽，通過Ni-NTA樹脂去除，以達到純化目的蛋白的目的。

影響天然TEV酶活性的常見因素：1）PMSF和AEBSF（1mM），TLCK（1mM），Bestatin（1mg/ml）、Pestatin A（1mM），EDTA（1mM）以及E-64（3mg/ml），以上這些蛋白酶抑制劑對rTEV的活性沒有影響；2）Zn離子（＞5mM）對rTEV活性有抑制；3）與半胱反應(yīng)的試劑也是rTEV的潛在抑制劑。

來源：大腸桿菌

外觀：無色透明液體

比活力：5U/μl

活性定義：在1×rTEV Buffer（50mM Tris，pH8.0，0.5mMEDTA，1mMDTT）中，30℃反應(yīng)1h，剪切>85%的3μg底物所需要的酶量定義為一個活性單位。

純化（Purification）：Ni親和純化

純度：≥95%（by SDS-PAGE）

產(chǎn)品組份：

rTEV Protease（5U/μl）—————200μl

rTEV Buffer 1（20×）——————2ml

rTEV Buffer 2（1000×）—————50μl
儲存條件：-20℃，有效期一年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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