產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱(chēng)	英文名稱(chēng)	規(guī)格	貨號(hào)
紅色熒光標(biāo)記人源高密度脂蛋白	Human DiI-High Density Lipoprotein, (Human DiI-HDL)	500μg	CS-01F98168

我司提供的Human DiI-HDL為無(wú)菌包裝，可以直接稀釋使用。除提供DiI-HDL，我們還提供不帶標(biāo)記的HDL，I125標(biāo)記的HDL。

脂蛋白在人體中主要起到運(yùn)輸脂質(zhì)（如、脂質(zhì)、甘油三酯）的作用，按照分子量大小，主要分為以下幾種（從高到低）：乳糜（CM）、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白（HDL）等。其中HDL是密度高的脂蛋白，不像其他大分子脂蛋白，主要將脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞，HDL是將脂質(zhì)運(yùn)出細(xì)胞，因此，高密度脂蛋白具有清除血管內(nèi)多余血脂、清除血垢、清潔血管、維持細(xì)胞內(nèi)量的相對(duì)衡定的作用，從而限制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，起到抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

本品Human DiI-High Density Lipoprotein為熒光探針DiI（1,1-dioctadecyl-3,3,3,3- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate）標(biāo)記的高密度脂蛋白，可以用來(lái)觀察培養(yǎng)細(xì)胞的HDL結(jié)合位點(diǎn)，或篩選HDL受體表達(dá)缺陷型細(xì)胞突變株。也可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞受體水平，或檢測(cè)組織內(nèi)的受體水平。

制備方法

純化的人健康血漿來(lái)源的HDL直接標(biāo)記上DiI熒光探針，然后通過(guò)速離心以及透析的方法純化回收標(biāo)記產(chǎn)物，并濾膜過(guò)濾除菌。純化的DiI-HDL溶于含0.02mM EDTA的PBS，pH7.4中。

濃度：0.8-3.0mg/ml

外觀：乳狀液體

吸光度比例（Absorbance Ratio）：DiI/Protein=555nm/275nm=1.4

緩沖液組分（Buffer Components）：0.02mM EDTA inPBS,pH7.4
儲(chǔ)存條件：4℃，無(wú)菌避光，有效期6周

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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