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紅色熒光標記人源低密度脂蛋白（Human DiI-LDL）是標記熒光探針Dil（1,1-dioctadecyl-3,3,3,3- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate）的LDL，可以用來觀察培養(yǎng)細胞的LDL結(jié)合位點，或篩選LDL受體表達缺陷型細胞突變株。也可以通過流式細胞術評估細胞受體水平，或檢測組織內(nèi)的受體水平。 DiI-LDL是研究細胞內(nèi)吞作用非常好的標記物。

低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein，簡稱為LDL）是通過脂蛋白酯酶的水解作用，脫去極低密度脂蛋白（VLDL）中的甘油三脂，釋放游離脂肪酸轉(zhuǎn)化而來的。因甘油三酯的去除使得所占比例提高，增加顆粒本身密度，從而得到LDL。LDL與脊椎細胞表面的受體特異性結(jié)合，然后通過受體介導的內(nèi)吞作用將運輸?shù)饺砀魈幖毎?。因此?/span>LDL可以用來研究受體介導的內(nèi)吞作用過程，尤其是在動脈粥樣硬化等疾病中，血漿來源的LDL還可用于研究LDL在功能和代謝中的氧化作用。

我司提供的Human DiI-LDL為無菌包裝，可以直接稀釋使用。除提供DiI-LDL，我們還提供不帶標記的LDL，以及修飾化的LDL如乙?；?/span>LDL（Ac-LDL），以及氧化修飾的LDL（Ox-LDL）。

制備方法

純化的人健康血漿來源的LDL直接標記上DiI熒光探針，然后通過速離心以及透析的方法純化回收標記產(chǎn)物，并濾膜過濾除菌。純化的DiI-LDL溶于含0.02 mM EDTA的PBS，pH 7.4中。

濃度：0.8-3.0 mg/ml

外觀：乳狀液體

吸光度比例（Absorbance Ratio）：Dil/Protein=555nm/275nm=1.30

緩沖液組分（Buffer Components）：0.02 mM EDTA in PBS, pH 7.4
儲存條件：4℃，無菌避光，有效期6周

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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