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考馬斯亮藍(lán)（Coomassie brilliant blue）是兩種相似三苯甲烷染料的總稱，有G250和R250兩種，結(jié)構(gòu)上前者比后者多了2個(gè)甲基，命名上 “G”為Green 的縮寫，因G250的藍(lán)色染料泛淺綠色；命名上“R”為Red的縮寫，因R250的藍(lán)色染料呈微紅色調(diào)；“250”表示考馬斯亮藍(lán)的純度。生化實(shí)驗(yàn)中常將考馬斯亮藍(lán)用于蛋白定量和蛋白電泳中蛋白染色。工作原理是：通過與蛋白質(zhì)內(nèi)的氨基和羧基基團(tuán)間的靜電結(jié)合作用以及范德華力，考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)形成但非共價(jià)鍵連接的復(fù)合物。蛋白-染料復(fù)合物的形成穩(wěn)定染料攜帶的負(fù)電荷陰離子（如磺酸基），從而產(chǎn)生在膜上或者膠上肉眼可見的藍(lán)色。

考馬斯亮藍(lán)R250（Coomassie brilliant blue R250）更多用于電泳蛋白的染色，染色靈敏度比氨基黑高5倍，可達(dá)0.1µg蛋白。R250染色后需要褪色，才能進(jìn)行蛋白條帶的觀察。

考馬斯亮藍(lán)G250的檢測靈敏度雖然較低，但也可替代R250，使用一種快速而簡單的方法進(jìn)行蛋白染色。因其具有以下特性，即在低于pH 2.0時(shí)，溶液無色；pH 7.0時(shí)溶液呈深藍(lán)黑色；若發(fā)生酸化，溶液呈現(xiàn)透明的棕褐色。當(dāng)G250與蛋白結(jié)合，溶液又回到藍(lán)色，主要因?yàn)榈鞍追肿又車哂懈行缘?/span>pH環(huán)境。合適條件下，當(dāng)把膠放在酸化的G250溶液中染色，顯示出藍(lán)色的蛋白條帶，背景呈淺琥珀色。此種方法條帶快速顯色，且背景顏色也很淺使得條帶看起來很清楚，則不需要做褪色處理。大部分蛋白用G250檢測的下限是0.5µg。雖然靈敏度降低，取而代之的是操作快速以及方便，比R250染色節(jié)省高達(dá)11 h。

中文別名：考馬斯亮蘭R250；酸性藍(lán)83；酸性艷藍(lán)6B；亮藍(lán)R；

英文別名：Brilliant Blue R; Brilliant Indocyanine 6B; C.I. number 42660; Acid Blue 83;

CAS：6104-59-2

分子式：C45H44N3NaO7S2

分子量：825.97

外觀：暗紅色至深暗紅或暗色粉末

溶解性：溶于熱水（1 mg/ml），乙醇和甲醇
儲(chǔ)存條件：室溫

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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