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本品適用于凝膠電泳以及固相金屬離子親和層析（IMAC）的準(zhǔn)備步驟，用作還原劑來(lái)破壞蛋白內(nèi)或蛋白間的二硫鍵。也特別適用于馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)半胱殘基反應(yīng)，它能夠預(yù)防半胱殘基形成二硫鍵，也不會(huì)像DTT或β-ME，本身易與馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)。RNA分離實(shí)驗(yàn)也常用于組織勻漿步驟。

三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽（TCEP hydrochloride, TCEP•HCl）是一種不含硫醇基且無(wú)臭的化合物，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)中，用作多肽或蛋白質(zhì)的二硫鍵還原劑。與其他類似的還原劑如二硫蘇糖醇（DTT），β-巰基乙醇（β-ME）相比，TCEP•HCl 具有多種優(yōu)點(diǎn)：1）無(wú)異味——實(shí)驗(yàn)臺(tái)上使用即可，勿需通風(fēng)櫥；2）穩(wěn)定性高——化合物本身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性使得在操作、使用以及保存的過(guò)程中不需要做任何預(yù)防措施來(lái)避免氧化發(fā)生。不會(huì)揮發(fā)，室溫反應(yīng)即可。室溫穩(wěn)定，抗空氣氧化。水溶性緩沖液，酸液以及堿液中穩(wěn)定。不會(huì)與蛋白中的其他功能基反應(yīng)；3）pH工作范圍廣——幾乎溶于任何pH值的水溶性緩沖液，pH有效工作范圍為1.5-9.0。直接溶于水后的pH值約為2.5；4）還原性——對(duì)于大部分實(shí)驗(yàn)，5-50 mM TCEP•HCl即可提供足夠的摩爾力，于室溫條件作用幾分鐘來(lái)充分還原二硫鍵；5）兼容性廣——不含有硫醇基，進(jìn)行下游的巰基修飾實(shí)驗(yàn)如馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)不需要提前去除此還原劑。

中文別名：TCEP鹽酸鹽；三(2-酰乙基)磷鹽酸鹽；三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽

英文別名：Tris-(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride

CAS：51805-45-9

分子式：C9H15O6P•HCl

分子量：286.7

密度（Density）：1.041 g/mL at 25 ℃

外觀：白色晶體

熔點(diǎn)：177℃

溶解性：溶于水（50mg/mL）

純度：＞99%
儲(chǔ)存條件：2～8℃保存，避光和避潮

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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