產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
kFluor594標記抗兔免疫熒光染色試劑盒	Immunol Fluorescence Staining Kit with kFluor594-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	300T	CS-01F98099

適用于細胞或組織切片的免疫熒光染色。在有適當?shù)囊豢箼z測特定的目標蛋白時，就可以使用免疫熒光染色試劑盒檢測到紅色、綠色或藍色等熒光。含有kFluor 594標記的山羊抗兔IgG(H+L)抗體，可以用于檢測兔來源的相應(yīng)一抗，在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到非常明亮的遠紅外熒光。kFluor594（Ex/Em：591nm/614nm）是一種常用的非常明亮的紅色熒光探針。通常該熒光探針被激發(fā)后肉眼不能觀察到激發(fā)出來的長波長熒光，但可以被很多成像系統(tǒng)例如激光共聚焦顯微鏡等所檢測到。

本試劑盒提供了含有熒光標記抗體穩(wěn)定劑的免疫熒光染色二抗稀釋液，可以確保熒光標記抗體稀釋后在4℃可以保存長達6個月，并且在6個月內(nèi)至少可以重復使用10次。

本試劑盒含有抗熒光淬滅封片液，可以使熒光更加持久。

本試劑盒對于六孔板內(nèi)的細胞樣品或常規(guī)切片，至少可以檢測300個樣品。

注意事項：

1. 需熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡。

2. 在使用抗熒光淬滅封片液的情況下可以減緩淬滅，但仍宜盡量避光，特別是需要盡量縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間。

3. 熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，染色后宜盡快進行熒光顯微鏡下的觀察。如果不能及時觀察可以4℃避光保存，但存放時間通常不宜過一周，隨著存放時間的延長可能會導致觀察效果越來越差。免疫熒光染色效果的好壞和一抗的關(guān)系非常密切。建議選購有較多文獻報道的并注明可以用于免疫熒光染色的一抗用于本實驗。

4. 如果觀察時發(fā)現(xiàn)熒光過弱，可以適當提高一抗的濃度；如果熒光還是比較弱，可以適當提高熒光標記抗體的濃度。

5. 需自行配制用于免疫熒光染色的相關(guān)試劑，需自備蓋玻片和載玻片。
6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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