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適用于細(xì)胞或組織切片的免疫熒光染色。在有適當(dāng)?shù)囊豢箼z測特定的目標(biāo)蛋白時，就可以使用免疫熒光染色試劑盒檢測到紅色、綠色或藍(lán)色等熒光。免疫熒光染色試劑盒－抗小鼠Cy3，含有Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體，可以用于檢測小鼠來源的相應(yīng)一抗，觀察到的顏色為非常鮮艷的紅色。

Cy3（Ex/Em：550nm/570nm）是近年新開發(fā)的一種紅色熒光探針。它比絕大部分其它的紅色熒光探針更加明亮，更加不容易淬滅，而且背景更低。

本試劑盒提供了含有熒光標(biāo)記抗體穩(wěn)定劑的免疫熒光染色二抗稀釋液，可以確保熒光標(biāo)記抗體稀釋后在4℃可以保存長達(dá)6個月，并且在6個月內(nèi)至少可以重復(fù)使用10次。

本試劑盒含有抗熒光淬滅封片液，可以使熒光更加持久。

本試劑盒對于六孔板內(nèi)的細(xì)胞樣品或常規(guī)切片，至少可以檢測300個樣品。

注意事項(xiàng)

1. 需熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡。

2. 在使用抗熒光淬滅封片液的情況下可以減緩淬滅，但仍宜盡量避光，特別是需要盡量縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間。

3. 熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，染色后宜盡快進(jìn)行熒光顯微鏡下的觀察。如果不能及時觀察可以4℃避光保存，但存放時間通常不宜過一周，隨著存放時間的延長可能會導(dǎo)致觀察效果越來越差。免疫熒光染色效果的好壞和一抗的關(guān)系非常密切。建議選購有較多文獻(xiàn)報道的并注明可以用于免疫熒光染色的一抗用于本實(shí)驗(yàn)。

4. 如果觀察時發(fā)現(xiàn)熒光過弱，可以適當(dāng)提高一抗的濃度；如果熒光還是比較弱，可以適當(dāng)提高熒光標(biāo)記抗體的濃度。

5. 需自行配制用于免疫熒光染色的相關(guān)試劑，需自備蓋玻片和載玻片。
6. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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