產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱(chēng)	英文名稱(chēng)	規(guī)格	貨號(hào)
BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(WB IHC)	BCIP/NBT Kit(40×)	40ml	CS-01F98014

BCIP是堿性磷酸酶佳的底物組合之一。在堿性磷酸酶催化下，BCIP會(huì)被水解而產(chǎn)生反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物與NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色化合物。該試劑盒可用于AP系統(tǒng)的IHC 和Western Blot 實(shí)驗(yàn)的酶促顯色。在AP催化下，在組織切片或印跡膜上結(jié)合了AP偶聯(lián)物的地方產(chǎn)生深藍(lán)色沉淀，可根據(jù)顏色反應(yīng)來(lái)確定目的蛋白的位置及表達(dá)情況。

注意事項(xiàng)：

1、工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，配制好的工作液1小時(shí)內(nèi)有效。

2、工作液用量必需充足，保證完全覆蓋組織片或印跡膜。

3、為獲得佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)務(wù)必優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

4、NBT有毒，使用時(shí)請(qǐng)采取必要的防護(hù)措施。

5、本產(chǎn)品僅用于科研，不能用于人體實(shí)驗(yàn)或人體治療。

操作步驟：

1、BCIP/NBT顯色工作液配制：根據(jù)需要量，將40×BCIP、40×NBT和BCIP/NBT Buffer以1：1：38的體積比混勻后，即為BCIP/NBT顯色工作液。

2、顯色：

1)印跡膜顯色：將配制好的工作液滴加在印跡膜上(或?qū)⒂≯E膜傾入到BCIP/NBT顯色工作液中)，室溫避光孵育3-10分鐘。顯色完畢后，將膜浸入水中，終止反應(yīng)。

2)組織切片或細(xì)胞爬片顯色：滴加適量的BCIP/NBT顯色工作液于需要顯色的組織切片或細(xì)胞爬片上，室溫避光孵育3-10分鐘。顯微鏡下觀察控制顯色時(shí)間，當(dāng)達(dá)到佳顯色效果后，自來(lái)水沖洗終止顯色。顯色后的切片經(jīng)復(fù)染、脫水透明，封片后可長(zhǎng)期保存。
儲(chǔ)存條件：2～8℃

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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