產(chǎn)品目錄

SDS-PAGE是蛋白質(zhì)科學(xué)研究中為常用的技術(shù)之一，使用常規(guī)SDS-PAGE電泳緩沖液(TG，Tris-Glycin系統(tǒng))進行電泳時，電泳所需的時間一般為90分鐘左右(mini膠)，應(yīng)用本產(chǎn)品可使同樣的mini膠的SDS-PAGE所需的電泳時間縮短至20-30min，同時電泳后的條帶較使用常規(guī)的TG電泳緩沖液所跑出的條帶分辨率提高且更加清晰。本產(chǎn)品的使用非常簡單，只需將您使用的常規(guī)TG電泳緩沖液系統(tǒng)更換為本產(chǎn)品的稀釋液，調(diào)整電壓后進行電泳即可，無需添加任何實驗步驟。同時稀釋為工作液的本產(chǎn)品可重復(fù)使用4-5次。本產(chǎn)品既可節(jié)省您寶貴的時間也可降低您的實驗成本。

注意事項：

1、操作時請務(wù)必佩戴手套，如濺到皮膚上，請立即用大量水沖洗。

2、本產(chǎn)品中含有SDS，適合變性凝膠電泳，不適合非變性凝膠電泳。

3、應(yīng)用本產(chǎn)品所進行的SDS-PAGE的結(jié)果顯示，本產(chǎn)品的應(yīng)用會使蛋白的分辨范圍發(fā)生變化，同等濃度的凝膠，其分辨的低分子量要小于使用TG電泳緩沖液(見下表)。

操作步驟：(以Bio-Rad mini膠及相關(guān)配套設(shè)備為例)

1、本產(chǎn)品為10倍濃縮液，使用時用純水10倍稀釋后配制成工作液(例如：取100ml本產(chǎn)品后用純水定容至1 L)。

2、將適量的本產(chǎn)品加入到電泳槽的內(nèi)、外槽中，調(diào)整電源為恒壓200-250 V進行電泳。電泳指示劑溴酚藍至凝膠底部，所需時間約20-30 min。

3、電泳完成后收集電泳槽內(nèi)、外槽電泳液，4℃保存，可重復(fù)使用4-5次，但如發(fā)生渾濁請勿使用。
儲存條件：室溫

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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