產(chǎn)品目錄

本產(chǎn)品為基于三甘醇(16原子間隔臂)的瓊脂糖，可快速、溫和、特異性地純化包含結(jié)合序列的非變性蛋白質(zhì)，如-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化物酶等，尤其適用于在大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞和哺育動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的GST融合表達(dá)蛋白。該填料具有很好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，使用壽命長，使用方便，批次重復(fù)性好，可一步分離得到純度較高的目標(biāo)蛋白，純化條件溫和，可保證蛋白的活性。

支持物：CL-6B瓊脂糖凝膠

載量：5-10 mg GST標(biāo)簽蛋白/ml 填料

粒徑：50-160μM

注意事項(xiàng)：

1、請(qǐng)勿將 GST瓊脂糖凝膠冷凍、干燥和離心，整個(gè)純化過程中切忌凝膠脫水變干。

2、蛋白層析應(yīng)使用高純度的試劑和水，層析前緩沖液應(yīng)用0.45μM濾膜過濾后使用。另外為防止柱子阻塞，上柱前建議將裂解液進(jìn)行離心，或者使用0.45μM濾膜過濾。

3、GST 融合蛋白與還原型的結(jié)合比較緩慢，為獲得大結(jié)合量，上樣流速建議為：0.2-1ml/min(6ml層析柱)，0.5-2ml/min(12ml層析柱)。對(duì)于吸附效果不好的樣品，可以先把介質(zhì)和樣品混合，輕輕振搖 2-4小時(shí)，再裝柱，用平衡緩沖液進(jìn)行重新平衡、洗脫等操作，另外在細(xì)菌抽提試劑中添加5 mM DTT，可以顯著提高GST標(biāo)簽結(jié)合能力。

4、不同的 GST 融合蛋白取得佳純化效果所需還原型濃度、洗脫體積和洗脫時(shí)間可能有所不同。必要時(shí)需對(duì)流穿液、洗脫液進(jìn)行 SDS-PAGE 以及 Western 雜交分析，以確定佳純化條件。

5、GST 融合蛋白以包涵體形式存在時(shí)不能與介質(zhì)結(jié)合，必須先進(jìn)行變性、復(fù)性、透析處理后才能用介質(zhì)進(jìn)行純化。建議優(yōu)化蛋白表達(dá)條件盡量使蛋白可溶性表達(dá)。
6、如后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要除去洗脫液中還原型，可采用濾或透析的方法。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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