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Bradford法的檢測原理是考馬斯亮藍(lán)(Coommassie Brilliant Blue)G-250與蛋白質(zhì)的堿性和芳香族氨基酸特別是精(Arginine)在酸性介質(zhì)中結(jié)合后，溶液轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，溶液大吸收峰從465nm遷移到595nm，顏色的變化與蛋白質(zhì)濃度成正比。因此，可通過檢測595nm處的吸光度對溶液中蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定。

本試劑盒是根據(jù)常用的兩種蛋白濃度檢測方法之一Bradford法研制而成，實現(xiàn)了蛋白濃度測定的快速、穩(wěn)定和高靈敏度，并且檢測數(shù)據(jù)有很好的線性關(guān)系。

與測定蛋白濃度的其它方法如BCA法和Lowry相比，Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，尤其是還原試劑的影響。樣品中β-巰基乙醇的濃度可高達(dá)1M，DTT的濃度可高達(dá)5mM。但本試劑盒受略高濃度的去垢劑影響，需確保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20、60、80低于0.015%。含去垢劑的樣品推薦使用我公司的Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型，貨號：YTB0034)或BCA蛋白濃度測定試劑盒。

產(chǎn)品特點：

本試劑盒檢測速度極快，10～20個樣品只需不足10分鐘即可完成，和BCA法相比大大縮短了檢測時間。

本試劑盒檢測靈敏度高，小蛋白檢測量達(dá)到0.5μg。

本試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系好。常規(guī)的Bradford法的標(biāo)準(zhǔn)曲線是非線性的。
保存：4℃保存，一年有效。蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以-20℃長期保存。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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