產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型BCA法)	Enhanced BCA Protein Assay Kit	5000次\|500次\|200次	CS-01F97955

本試劑盒是根據(jù)目前常用的兩種蛋白濃度檢測方法之一BCA法研制而成，實(shí)現(xiàn)了蛋白濃度測定的簡單、高穩(wěn)定性、高靈敏度和高兼容性。

和的普通BCA蛋白濃度測定試劑盒(YT037)相比，靈敏度更高，檢測濃度下限達(dá)到10μg/ml，小檢測蛋白量達(dá)到0.2μg，待測樣品體積為1-20μl。顯色速度更快，相同的樣品孵育較短時(shí)間即可進(jìn)行吸光度測定。

,在20-1000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20、60、80。但本試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM，無EGTA，二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。不適用BCA法時(shí)建議試用的Bradford蛋白濃度測定試劑盒(YT034)。

試劑盒組份：

BCA試劑 A 500ml×2

BCA試劑 B 30ml

蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA) 30mg×2

蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液 5ml

注意事項(xiàng)：

1. 需酶標(biāo)儀一臺，測定波長為540-595nm之間，562nm佳。需96孔板。如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計(jì)測定，但測定時(shí)，需根據(jù)比色皿的小檢測體積，適當(dāng)加大BCA工作液的用量使不小于小檢測體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量可相應(yīng)按比例放大也可不變。使用分光光度計(jì)測定蛋白濃度時(shí)，每個(gè)試劑盒可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少。

2. 如發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身就有較高背景，請?jiān)囉玫?/span>Bradford蛋白濃度測定試劑盒(YT034)。

3. 為了加快BCA法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)用微波爐加熱，但是切勿過熱。

4. EDTA濃度必須小于10mM，不兼容EGTA。不適用BCA法時(shí)，請?jiān)囉玫?/span>Bradford蛋白濃度測定試劑盒(YT034)。

儲存條件：室溫。波長為540-595nm之間，562nm佳。需96孔板。如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計(jì)測定，但測定時(shí)，需根據(jù)比色皿的小檢測體積，適當(dāng)加大BCA工作液的用量使不小于小檢測體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量可相應(yīng)按比例放大也可不變。使用分光光度計(jì)測定蛋白濃度時(shí)，每個(gè)試劑盒可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少。

2. 如發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身就有較高背景，請?jiān)囉玫?/span>Bradford蛋白濃度測定試劑盒(YT034)。

3. 為了加快BCA法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)用微波爐加熱，但是切勿過熱。

4. EDTA濃度必須小于10mM，不兼容EGTA。不適用BCA法時(shí)，請?jiān)囉玫?/span>Bradford蛋白濃度測定試劑盒(YT034)。
儲存條件：室溫。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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