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產(chǎn)品屬性：

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
動物細(xì)胞裂解液A(非變性)	Animal Cell Lysis Solution(A)	100mL	CS-01F97920

英文名稱：Animal Cell Lysis Solution(A)

產(chǎn)品規(guī)格：100mL

本產(chǎn)品含有多種細(xì)胞裂解成分和蛋白酶抑制成分，可以在非變性或變性條件下迅速裂解組織或培養(yǎng)細(xì)胞，使之釋放出細(xì)胞內(nèi)蛋白，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.快速裂解，多種裂解成分經(jīng)過精心優(yōu)化，能快速使細(xì)胞裂解。

2. 非變性(BTN80807A)產(chǎn)品能大程度地保留蛋白天然結(jié)構(gòu)和功能，主要用于免疫沉淀和免疫共沉淀，還可以用于蛋白活性檢測(信號傳遞研究和酶動力學(xué)檢測)和Western Blot等各種后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.變性(BTN80807B)裂解細(xì)胞的效率更高，主要用于對抗原空間構(gòu)型不敏感的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，還可以用于Western Blotting。

4.適用于培養(yǎng)細(xì)胞(包括懸浮細(xì)胞)和新鮮組織。

儲存條件：常溫運(yùn)輸、4℃保存，有效期一年。

注意事項(xiàng)：

1. 如果在本產(chǎn)品中額外再加入終濃度為1×的、新鮮配制的蛋白酶抑制劑復(fù)合物，可以更有效地抑制蛋白酶活性，防止蛋白降解。

2. 如果用于信號傳遞研究，好在本產(chǎn)品中加入終濃度為1×的、新鮮配制的磷酸酶抑制劑復(fù)合物。

3. 整個裂解步驟都要在冰浴或4℃操作。本產(chǎn)品和PBS 均需預(yù)先冷卻。
4. 本產(chǎn)品所含有較高濃度的去垢劑會對Bradford蛋白濃度測定有較大影響，因此只能使用BCA法測定蛋白濃度。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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