產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
pTG-T載體克隆試劑盒(含感受態(tài)細(xì)胞)	pTG-T Vector Cloning Kit with TOP10 Competent Cells	20次\|60次	CS-01F97856

本試劑盒適用于PCR產(chǎn)物的克隆，可將PCR產(chǎn)物連接到pTG-T載體上，便于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。DNA片段連接是經(jīng)常出問題的步驟，為了提高連接效率，本試劑盒提供了兩種連接Buffer供不同情況選擇：10×Ligation Buffer Ⅰ適合置于16℃連接過夜，可獲得佳連接效果；2×Ligation Buffer Ⅱ?yàn)榭焖龠B接Buffer，25℃連接10分鐘即可轉(zhuǎn)化，快捷方便。

英文名稱：pTG-T Vector Cloning Kit with 0 Competent Cells

產(chǎn)品規(guī)格：20次|60次

pTG-T是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體，它是由一種克隆載體在EcoRV酶切位點(diǎn)處切開，在兩側(cè)的3′端添加T而成。由于大部分耐熱聚合酶反應(yīng)時(shí)都會(huì)在PCR產(chǎn)物的3′端添加一個(gè)A，可與pTG-T 3′端的T互補(bǔ)連接，因此可大大提高PCR產(chǎn)物的連接和克隆效率。連接使用的PCR片段3′端應(yīng)帶有A末端，如果是使用pfu等高保真聚合酶擴(kuò)增的不帶A末端的片段，應(yīng)使用平末端連接試劑盒先加A末端后再連接。

試劑盒中配備了高效率的連接試劑、對照用螺旋質(zhì)粒和0感受態(tài)細(xì)胞等，可以方便的連接和轉(zhuǎn)化。帶有插入片段的重組子可根據(jù)α互補(bǔ)原理，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，判斷載體中有無外源基因的插入（白色克隆為陽性重組克隆，藍(lán)色的為載體自連的克隆，具體篩選原理參考分子克隆等書籍）?？寺『?，可使用通用引物T7、SP6進(jìn)行測序。
保存條件：-20℃保存，避免反復(fù)凍融（載體和連接試劑可以適當(dāng)?shù)姆盅b成小份，防止反復(fù)凍融，以保證質(zhì)量）。感受態(tài)細(xì)胞需要嚴(yán)格的在-70℃凍存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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