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pET-Dual-N-GST是一種用于在大腸桿菌中高效共表達兩種目的蛋白的質(zhì)粒，其中一種蛋白可以帶上GST標簽(Glutathione S-transferase tag,GST tag)。本質(zhì)粒包含兩個多克隆位點(MCS)，每個多克隆位點前都有一個T7啟動子/lac操作子和一個核糖體結(jié)合位點(rbs)，因此都可以在異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導下高效啟動目的蛋白的表達。本質(zhì)粒為氨芐青抗性。

在共表達兩個蛋白的復合物時，通常宜把較難表達的基因克隆到個多克隆位點，并在其N端引物設(shè)計時加入PreScission蛋白酶識別的八肽序列(LEVLFQGP)，宜把較易表達的基因克隆到個多克隆位點。這樣通過GST柱純化，可分離純化獲得帶有GST標簽的蛋白復合物，配合使用生產(chǎn)的PreScission Protease4℃酶切過夜，天收集穿柱液即可獲得蛋白復合物，這為后續(xù)進行蛋白復合物的功能檢測、蛋白結(jié)晶等工作帶來了極大的便利。PreScission蛋白酶酶切發(fā)生在八肽序列的Q和G之間，因此在酶切去除GST標簽的時候會在目的蛋白的N端留下兩個額外的氨基酸殘基GP。當然，本質(zhì)粒也可以只在個多克隆位點插入目的基因，這樣就會僅表達一個含有N端GST標簽的目的蛋白。

使用說明：

1．使用1μg包裝的本產(chǎn)品時，請先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)粒可以通過酶切電泳進行鑒定，或通過測序進行鑒定。

2．100μg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1μg/μl，共1ml?？梢灾苯佑糜诿盖谢蛘咿D(zhuǎn)染細胞。
3．pET-Dual-N-GST質(zhì)粒在其多克隆位點適當酶切后可以插入待表達的目的基因，構(gòu)建的質(zhì)粒可以用常規(guī)方法轉(zhuǎn)入表達菌株。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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