產(chǎn)品目錄

SARS-CoV-2 N基因質(zhì)粒是我公司推出的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，用于表達(dá)C端帶有Myc標(biāo)簽(EQKLISEEDL)的SARS-CoV-2核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein)，可以使用抗Myc標(biāo)簽的抗體來(lái)識(shí)別N蛋白的表達(dá)，或進(jìn)行免疫共沉淀分析等。該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子，可以高效啟動(dòng)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，質(zhì)粒為氨芐青抗性。

N蛋白是冠狀病毒的四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白之一，由N基因編碼，為核衣殼磷酸蛋白，是冠狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是冠狀病毒編碼蛋白中表達(dá)豐度高的蛋白。N蛋白在病毒的組裝、釋放以及病毒的致病性方面發(fā)揮重要作用。冠狀病毒N蛋白功能相對(duì)保守，包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)獨(dú)立的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：N端RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(N-terminal RNA binding domain，NTD)和C端結(jié)構(gòu)域(CTD)，中間還有一個(gè)絲和精富集的連接區(qū)(SR linker)。冠狀病毒的N蛋白能與病毒RNA緊密結(jié)合，通過(guò)螺旋堆積將RNA包裝，從而保護(hù)病毒的基因組RNA。在病毒感染過(guò)程中，N蛋白是所有結(jié)構(gòu)蛋白中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)烈的蛋白，由于其分子量小，沒有糖基化修飾，易于蛋白表達(dá)純化，因此常作為冠狀病毒血清學(xué)檢查為合適的抗原。

使用說(shuō)明：

1．使用1μg包裝的本產(chǎn)品時(shí)，請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)酶切電泳進(jìn)行鑒定，或通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。
2．100μg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1μg/μl，共1ml?？梢灾苯佑糜诿盖谢蛘咿D(zhuǎn)染細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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