產(chǎn)品目錄

本制品是一種非常高效的基于陽離子脂質(zhì)體的新型轉(zhuǎn)染試劑，專門適用于懸浮培養(yǎng)的HEK293細胞，如Freestyle 293-F等，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和重組蛋白大量表達。本產(chǎn)品與Thermo公司的293fectin Transfection Reagent和Merck公司的293-Free Transfection Reagent的用途和使用效果基本一致，與Thermo公司的Freestyle MAX Reagent相比，用于懸浮培養(yǎng)的293細胞時效果基本一致。

LP293S轉(zhuǎn)染試劑對Freestyle 293-F細胞的轉(zhuǎn)染效率非常高(約85%)，同時細胞毒性極低、重復(fù)性好、操作簡單、轉(zhuǎn)染后無需更換培養(yǎng)液。

LP293S轉(zhuǎn)染試劑也同樣適用于293系列貼壁細胞的轉(zhuǎn)染，但轉(zhuǎn)染293系列貼壁細胞時，推薦使用性價比更高的LP293。

LP293S轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染時血清的存在不會影響轉(zhuǎn)染效率，這樣可以減少避免很多陽離子脂質(zhì)體因為需要在轉(zhuǎn)染時去除血清而對細胞造成的損傷。

LP293S轉(zhuǎn)染試劑毒性極低，轉(zhuǎn)染后無需更換培養(yǎng)液，一方面細胞的良好生長狀態(tài)保證了目的蛋白的大量表達，另一方面又減少了操作步驟并節(jié)省了培養(yǎng)液。

LP293S轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Freestyle 293-F細胞目的蛋白表達質(zhì)粒后，通常在48-72小時后達到比較理想的蛋白表達水平。

LP293S轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率可以通過轉(zhuǎn)染表達EGFP等熒光蛋白的質(zhì)粒進行快速鑒定。

保存條件：

4℃保存。長期不使用可以-20℃保存。-20℃保存后會有沉淀產(chǎn)生，須37℃水浴30min，使完全溶解后才能用于細胞轉(zhuǎn)染。

注意事項：

使用高純度的DNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。對于質(zhì)粒，可以使用我公司的質(zhì)粒大量抽提試劑盒(YT003)進行抽提，以保證可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

-20℃等低溫保存后本產(chǎn)品會結(jié)凍，溶解時會出現(xiàn)沉淀，此時37℃水浴30min，使完全溶解就可以用于細胞轉(zhuǎn)染，并且不會影響使用效果。收到的本產(chǎn)品可能會因為干冰等低溫運輸導(dǎo)致溶解后出現(xiàn)沉淀，37℃水浴30min，使完全溶解就可以正常使用了。

轉(zhuǎn)染前細胞必須處于良好的生長狀態(tài)。

需自備不含抗生素的無血清Freestyle 293-F細胞培養(yǎng)液，可以使用SMM 293-T1培養(yǎng)基(M293TI-1)。

LP293S轉(zhuǎn)染試劑不能vortex或離心，可以用移液器輕輕吹打混勻或緩慢搖動混勻。

LP293S轉(zhuǎn)染試劑使用后請立即蓋好蓋子，避免長時間暴露在空氣中，影響轉(zhuǎn)染效率。

本產(chǎn)品對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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