產(chǎn)品目錄

本制品是一種用于表達(dá)N端同時含有His標(biāo)簽(His tag)和SUMO標(biāo)簽(SUMO tag)雙標(biāo)簽的目的蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒。His標(biāo)簽有利于通過親和層析方法進(jìn)行目的蛋白的純化，而SUMO標(biāo)簽則有利于改善目的蛋白的折疊，增加目的蛋白可溶性和產(chǎn)量。表達(dá)后的含有目的蛋白的融合蛋白可以通過PreScission蛋白酶酶切去除His標(biāo)簽但保留SUMO標(biāo)簽，也可以通過SUMO Protease 酶切去除N端的His和SUMO兩個標(biāo)簽。本質(zhì)粒為卡那抗性。

如果通過無縫克隆技術(shù)(Seamless Cloning Kit，無縫克隆試劑盒)在SUMO標(biāo)簽酶切位點(diǎn)后插入目的蛋白ATG起始的序列，SUMO Protease酶切后，可以確保表達(dá)的目的蛋白氨基端(N端)剛好從甲硫(Methione)開始，不會增加或減少任何一個氨基酸，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的正確表達(dá)。

本質(zhì)粒含有T7啟動子/lac操縱子，可以在異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下高效啟動目的蛋白表達(dá)。在多克隆位點(diǎn)根據(jù)讀碼框插入目的基因就可以表達(dá)N端含有His和SUMO雙標(biāo)簽的目的蛋白。

本載體在N端His標(biāo)簽后含有PreScission Protease識別的八肽序列LEVLFQGP，因此在目的蛋白純化后可以利用PreScission Protease酶切除去N端的His標(biāo)簽，但在SUMO融合蛋白的N端還會保留兩個額外的氨基酸GP。在用SUMO Protease酶切除去SUMO標(biāo)簽的時候，SUMO Protease識別的是SUMO蛋白的空間結(jié)構(gòu)，通過無縫克隆的方式在CAGATTGGTGGA (對應(yīng)氨基酸為QIGG)序列后插入目的蛋白的基因序列，在用SUMO Protease進(jìn)行酶切的時候，其正好在QIGG后產(chǎn)生酶切，因此可以產(chǎn)生不帶任何額外氨基酸的目的蛋白，而這是很多做蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究的研究人員所夢寐以求的。

可以采用如His-tag Purification Resin(耐還原螯合型) /His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(耐還原螯合型) (貨號YT046)以及His-tag Purification Resin(變性劑耐受型) /His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(變性劑耐受型)等純化本質(zhì)粒表達(dá)的目的蛋白，也可以使用His-tag抗體檢測或少量分離純化目的蛋白。

使用說明：

使用1μg包裝的本產(chǎn)品時，請先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)粒可以通過酶切電泳進(jìn)行鑒定，或通過測序進(jìn)行鑒定。

100μg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1μg/μl，共1ml。可以直接用于酶切或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
pET-N-His-PreScission-SUMO質(zhì)粒在其多克隆位點(diǎn)適當(dāng)酶切后可以插入待表達(dá)的目的基因，或者也可以同無縫克隆技術(shù)在SUMO標(biāo)簽之后插入目的基因，構(gòu)建的質(zhì)?？梢杂贸Ｒ?guī)方法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株進(jìn)行表達(dá)純化。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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