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Rosetta-gami(DE3)pLysS化學感受態(tài)細胞

  • 產品貨號：CS-01F97799
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：187
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：10×100μl|50×100μl
  • 品牌名稱:莼試
  • 分子式：
  • 分子量：

簡介內容：Rosetta-gami(DE3)pLysS化學感受態(tài)細胞現(xiàn)貨供應，價格實惠。

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標簽:Rosetta-gami(DE3)pLysS化學感受態(tài)細胞 10×100μl 50×100μl 

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Rosetta-gami(DE3)pLysS化學感受態(tài)細胞

Rosetta-gami(DE3)pLysS Chemically Competent Cel

10×100μl|50×100μl

CS-01F97799

Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株聚合了不同原核表達菌株的優(yōu)勢：

Rosetta-gami賦予其Rosetta和Origami的優(yōu)點——補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對應的tRNA，提高外源基因的表達水平，并且包含突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase)(trxB)和還原酶(glutathione reductase)(gor)基

因，表達主要還原途徑的兩個關鍵酶。有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增蛋白的可溶性。

該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)(DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)，適合 T7啟動子誘導的蛋白表達。

該菌株攜帶的pLysS質粒含有表達T7的基因，能夠降低目的基因的背景表達水平，但不干擾IPTG誘導的表達，適合表達毒性蛋白和非毒性蛋白。Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株具有卡那，氯，鏈，四環(huán)素抗性，經pUC19質粒檢測轉化效率高達108cfu/μg。

保存條件：-80℃

基因型：

Δ(ara-leu)7697ΔlacX74phoAPvuIIphoRaraD139ahpCgalEgalKrpsL(DE3)F[lac+lacIqpro]gor522::Tn10 trxB pLysSRARE2(CamR，StrR，TetR)

操作說明：

1.取100μl冰上融化的Rosetta-gami(DE3)pLysS感受態(tài)細胞，加入目的質粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42 回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項：

1.感受態(tài)細胞好在冰上融化。

2.混入質粒時應輕柔操作。

3.轉化高濃度的質?？上鄳獪p少終用于涂板的菌量。

4.誘導時，IPTG濃度可選(0.1-2mM均可)。

5.為獲得需要量的蛋白，佳誘導時間，溫度，IPTG濃度需實驗者優(yōu)化。

6.BL21(DE3)pLysS菌株攜帶pLysS質粒，除復蘇培養(yǎng)基為無抗生素外，其余所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液均應含有34 μg/ml氯，以防質粒丟失。
7.具有卡那抗性，不能用于具有卡那抗性質粒的表達。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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