產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
Rosetta-gami B(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	Rosetta-gami B(DE3)Chemically Competent Cell	10×100μl\|50×100μl	CS-01F97798

Rosetta-gami B(DE3)菌株聚合了BL21，Tuner，Origami和Rosetta四種菌株的優(yōu)點(diǎn)：

lacY1基因(半乳糖苷透性酶基因)突變賦予其Tuner菌株的優(yōu)點(diǎn)——IPTG以均一速度進(jìn)入體系中大腸桿菌的每個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生更加嚴(yán)格、均一的濃度依賴。

pRARE賦予其Rosetta菌株的優(yōu)點(diǎn)——補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平。

gor522::Tn10 trxB賦予其Origami菌株的優(yōu)點(diǎn)——突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase)(trxB)和還原酶(glutathione reductase)(gor)基因，它們是還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其突變有利于高效形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增蛋白的可溶性。

該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)(DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)適合 T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)。

Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有卡那，氯，四環(huán)素抗性，由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)108 cfu/μg DNA。

保存條件：-80℃

基因型：

F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10 trxB pRARE(Camr，Kanr，Tetr)

操作說(shuō)明：

1.Rosetta-gamiB(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 μg/ml氯及所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

1.感受態(tài)細(xì)胞好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選(0.1-2mM均可)。

5.為獲得需要量的蛋白，佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。

6.具有卡那抗性，不能用于具有卡那抗性質(zhì)粒的表達(dá)。

pRARE賦予其Rosetta菌株的優(yōu)點(diǎn)——補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平。
gor522::Tn10 trxB賦予其Origami菌株的優(yōu)點(diǎn)——突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase)(trxB)和還原酶(glutathione reductase)(gor)基因，它們是還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其突變有利于高效形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增蛋白的可溶性。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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