產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
F-BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	F-BL21(DE3)Chemically Competent Cell	10×100μl\|50×100μl	CS-01F97791

介紹

BL21(DE3)菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體(如 pET系列)的基因。

λ噬菌體DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶，該區(qū)整合于BL21的染色體上，所以稱為BL21(DE3)。可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。F-BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，無需42℃熱激，37℃孵育步驟，只需冰浴，10min內(nèi)完成轉(zhuǎn)化、涂板操作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×107 cfu/μg DNA。

保存條件：-80℃

基因型：

F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)

快速轉(zhuǎn)化操作方法(10min)：

1.提前10分鐘將用到的篩選培養(yǎng)基平板拿到37℃預(yù)熱。

2.F-BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手EP管底輕輕混勻，冰中靜置5分鐘。

3.用200 μl槍將感受態(tài)細(xì)胞-DNA混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上，涂均勻，表面無水漬。

4.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

快速熱激轉(zhuǎn)化操作方法(25min,可提高轉(zhuǎn)化效率)

1.F-BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手EP管底輕輕混勻,，冰中靜置5分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘(晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率)。加入700 μl不含抗生素的LB，37℃，200 rpm復(fù)蘇10分鐘，涂板(均勻，表面無水漬)。
3.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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