產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞	AH109 Chemically Competent Cell	10×100μl\|50×100μl	CS-01F97780

AH109菌株來(lái)源于PJ69-2A酵母菌株，將lacZ報(bào)告基因引入PJ69-2A誕生了AH109，此菌株是GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蚺cMATα型酵母菌株Y187通過(guò)mating操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn)。

Transformation marker為：trp1，leu2，報(bào)告基因?yàn)椋?/span>lacZ，HIS3，ADE2，MEL1。

AH109-GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。

質(zhì)粒PGBKT7的篩選標(biāo)志為TRP1，用于表達(dá)DNA-BD(來(lái)自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒PGADT7的篩選標(biāo)志為LEU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768 ~881位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Prey)的融合蛋白。

GAL4系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N端1 ~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域(DNA-BD)和位于C端768 ~881位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。

DNA-BD能夠識(shí)別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。

而AD可以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

正常條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey發(fā)生相互作用，就會(huì)促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

AH109有四個(gè)報(bào)告基因：lacZ，HIS3，ADE2，MEL1，分別由三種不同的啟動(dòng)子(GAL1，GAL2，MEL1)啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只有GAL4識(shí)別的17bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。AH109感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，經(jīng)PGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA。保存條件：-80℃

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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