產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
常溫穩(wěn)定BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞	Extremely Stable BL21(DE3) Competent Cells	100μl×10支	CS-01F97768

本制品室溫可保存1個月、-20℃可保存2年（推薦保存溫度）、-80℃可長期保存性能無下降。運輸過程中無需干冰，可室溫運輸、可常規(guī)冰袋運輸（推薦運輸溫度）。本BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為熱激感受態(tài)細(xì)胞，專門用于蛋白表達(dá)（不可用于克隆和載體構(gòu)建），經(jīng)42℃熱激1分鐘可獲得105～106cfu/μg效價，可滿足質(zhì)粒轉(zhuǎn)化要求。該制品使用簡單、運輸、儲存方便。

產(chǎn)品組成：

組分規(guī)格

RTS BL21(DE3) Competent Cell 10支

Nano E.coli Transfection Reagent 600μl

保存條件：-20℃可保存半年，-70度可保存2年；可室溫運輸。

使用方法：

1．從-20℃冰箱中取出Nano E.coli Transfection Reagent徹底融化，放置于冰上。

注意：該試劑含長鏈帶電化合物，允許反復(fù)凍融20次，使用完畢后繼續(xù)-20℃保存。

2．取50μl Nano E.coli Transfection Reagent置于0.2ml EP管中，加入1～20ng質(zhì)粒DNA（不可使用連接產(chǎn)物），槍頭吹打混合均勻，冰上放置2～5分鐘。

注意：放置時間不要過30分鐘，過長時間會導(dǎo)致核酸聚合，從而影響轉(zhuǎn)化效價。

3．將上述混合物（50μl Nano E.coli Transfection Reagent和質(zhì)粒DNA）加入到一支RTS BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞干粉中，槍頭輕輕吹打，徹底溶解細(xì)胞干粉，置于冰上15分鐘。

注意：使用RTS BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞干粉前，輕甩干粉至管底部，如果發(fā)現(xiàn)干粉已經(jīng)溶解則不可使用。

4．置于42℃熱激1分鐘后，迅速置于冰上急冷2分鐘。

5．向熱激完畢的感受態(tài)細(xì)胞中，加入450μl不含抗生素的SOC培養(yǎng)基(或LB培養(yǎng)基)，37℃振蕩（225 rpm）培養(yǎng)60分鐘。使質(zhì)粒上抗性標(biāo)記基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。

6．取200μl復(fù)蘇菌液涂布到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板表面。

7．將平板置于37℃培養(yǎng)，12～18小時后可出現(xiàn)菌落。
8．獲得的表達(dá)菌，可使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，從而獲得重組蛋白。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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