產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
T Simple 載體連接試劑盒（不含多克隆位點）	T Simple vector ligation Kit	20次\|60次	CS-01F97684

本試劑盒T Simple Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體。這種載體是由pBlueScript II SK(+)質(zhì)粒改建而成，和傳統(tǒng)T載體ECOR V切開后加T方法不同，T Simple載體通過改造pBlueScript II SK(+)，在原pBlueScript II SK(+)多克隆位點引入 Xcm I酶切后使其原多克隆位點兩側的3’末端直接產(chǎn)生未配對的T堿基，因此有更高的重組效率。同時它消除了pBlueScript II SK(+)載體上的多克隆酶切位點，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。此時如果使用PCR擴增引物導入的酶切位點進行DNA酶切時，酶切反應將不會受到T載體上其它多克隆酶切位點上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。此外，本公司載體連接體系還有背景低（藍斑小于10%），重組率高（白斑中過90%有插入片段），可快速連接等特點。本說明書末列出了T Simple 載體相關的技術資料，其全序列可參照pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆酶切位點處序列稍有不同。

試劑盒組份：

T Simple Vector(30ng/μl)———————20μl

1000bp Control（30ng/μl）-——————5μl

10×PEG Enhancer-———————————50μl

10×Ligation Buffer-—————————40μl

2×Quick Ligation Buffer-———————100μl

T4 DNA ligase（5Uμl）—————————20μl

儲存條件：-20℃。
本制品別名：T載體克隆試劑盒

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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