產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
通用型T載體克隆菌落PCR檢測(cè)試劑盒	Universal T vector colony PCR identification Kit	80次\|400次	CS-01F97681

本試劑盒采用通用T載體引物研制的通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒，只需購買一種試劑盒，便可用于市面上所有常見的T載體(包括pGEM，pUC，pBluescript系列) 連接陽性克隆的鑒定。此外，采用T3,T7或者SP6做引物的菌落PCR鑒定試劑盒引物距離插入位點(diǎn)的距離非常短，因此在鑒定100bp左右或者更小片段的插入時(shí)，陰性克隆的引物二聚體條帶和陽性克隆擴(kuò)增條帶大小接近，無法區(qū)分。往往把引物二聚體的條帶看成是陽性擴(kuò)增條帶，造成假陽性。反之，造成假陰性。本試劑盒通用T載體引物在未插入片段時(shí)的距離至少有150bp以上，加上插入片段的長度，可以清晰的區(qū)分是插入片段擴(kuò)增出的條帶還是引物二聚體擴(kuò)增出的條帶。避免假陽性或者假陰性，大大提高了準(zhǔn)確性。本公司研發(fā)的一管便攜式PCR MasterMix預(yù)混系統(tǒng)，無需您一一加入各種成分，直接加入需篩選單菌落，經(jīng)過1小時(shí)左右的PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)即可得到重組菌落鑒定的結(jié)果。

試劑盒組份(400次)：

2 × Taq PCR MasterMix——————5ml

Universal primer F————————250μl

Universal primer R————————250μl

ddH2O———————————————5ml

注意事項(xiàng)：

1. 重組菌落鑒定時(shí)，挑取單菌落前，應(yīng)先做好標(biāo)記，便于鑒定后使用。

2. 挑取菌落時(shí)，應(yīng)選擇單菌落，不要挑取太多菌體，以免影響PCR 結(jié)果。

3. 設(shè)定PCR 程序時(shí)，請(qǐng)根據(jù)插入片段大小決定延伸時(shí)間，如果插入片段大小為1 kb以下，延伸時(shí)間30-45 秒即可，如果片段更長，可按此比例增加延伸時(shí)間。
儲(chǔ)存條件：-20℃。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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