產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
一管式定點(diǎn)突變?cè)噭┖?/span>	One Tube Site-specific Mutagenesis Kit	10次\|20次	CS-01F97678

本試劑盒是基于PCR原理向目的DNA片段（一般為質(zhì)粒）中引入堿基的點(diǎn)突變，多個(gè)鄰近密碼子的突變，單個(gè)或多個(gè)鄰近密碼子的缺失(deletion)或插入(insertion)等。一般宿主菌培養(yǎng)擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA是甲基化的，PCR擴(kuò)增新合成的DNA是非甲基化的。先以待突變的甲基化質(zhì)粒為模板，利用快高保真的SuperPfu聚合酶實(shí)現(xiàn)突變質(zhì)粒的合成（非甲基化，包含突變點(diǎn)，且有兩個(gè)缺刻點(diǎn)nick點(diǎn)），再利用Dpn I酶選擇性降解甲基化的模板質(zhì)粒，剩下的新合成非甲基化的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，質(zhì)粒中有兩個(gè)nick位點(diǎn)可以被大腸桿菌修復(fù)，得到的克隆就會(huì)含有預(yù)期的突變質(zhì)粒了。一般可以產(chǎn)生大于90%的突變效率。本試劑盒適用于<12kb甲基化質(zhì)粒中核苷酸的突變。

試劑盒組分(10次)：

SuperPfu DNA polymerase——————5μl

10×SuperPfu Buffer————————100μl

Dpn I——————-——————-——5μl

10mM dNTP Mixture-——————-——25μl

試劑盒特點(diǎn)：

1、簡(jiǎn)單，一個(gè)PCR管中完成所有操作，速度快。

2、采用部分重疊引物設(shè)計(jì)，使PCR呈指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳可見增加成功率。

3、效率高，使用Dpn I去除非突變模板，突變效率高達(dá)90%；不需要使用特殊感受態(tài)細(xì)胞降解非突變質(zhì)粒。

4、采用分子進(jìn)化改造的SuperPfu可以提供4倍-6倍于pfu的擴(kuò)增速率提高和3倍于pfu的高保真性。
儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期一年。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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