產(chǎn)品目錄

本試劑采用獨(dú)特配方的陽離子聚合物為主要成分，可以與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，保護(hù)DNA免受核酸酶的降解,在增加核酸穩(wěn)定性的同時, 提高轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合體穿越細(xì)胞膜的效率，這種獨(dú)特設(shè)計(jì)，顯著提高了基因轉(zhuǎn)染效率。此類試劑是目前非病毒介導(dǎo)方法中效率高的轉(zhuǎn)染試劑（不同種類細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可有明顯差異）。此外本品不被血清清除，血清和抗生素不影響其轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物可以直接加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基中。本品的細(xì)胞毒性很小，在適宜的條件下，根據(jù)推薦用量使用本試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞存活率高于90%.每一批產(chǎn)品出廠前都要對其轉(zhuǎn)染效率和毒性經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控。 1ml本DNA轉(zhuǎn)染試劑可進(jìn)行500次轉(zhuǎn)染（6孔板或35mm平皿）。

產(chǎn)品特點(diǎn)

1.適應(yīng)于眾多原代培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)染

2.適用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

3.適應(yīng)于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染

4.轉(zhuǎn)染效率高且穩(wěn)定，在有無血清存在的細(xì)胞培養(yǎng)基中均能獲得高效率轉(zhuǎn)染

5.細(xì)胞毒性低

6..轉(zhuǎn)染程序簡單，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)可以在半小時內(nèi)完成

注意事項(xiàng)：

1. 少量使用本試劑時，可取精確量的本試劑用無菌純水稀釋一定倍數(shù)，以便精確取樣量。該稀釋液可在4℃保存1月左右。

2. 細(xì)胞的生長狀態(tài)是轉(zhuǎn)染效率的一個主要決定因素。在實(shí)驗(yàn)條件許可的情況下，使用高質(zhì)量的培養(yǎng)液、優(yōu)質(zhì)血清等，可能會明顯提高轉(zhuǎn)染效率。

3. 本試劑在轉(zhuǎn)染中不受血清影響，所以本試劑/DNA復(fù)合物能直接加到含血清的培養(yǎng)基中，但稀釋本試劑和DNA的緩沖液不能混有血清，因?yàn)楸酒吩谥苽浔驹噭?/span>/DNA復(fù)合物之前可能會與血清中的蛋白質(zhì)反應(yīng)，影響轉(zhuǎn)染效率。

4. 如果細(xì)胞株很敏感，孵育2～4小時后除去轉(zhuǎn)染復(fù)合物并加入含血清的新鮮培養(yǎng)基。
儲存條件：4℃，有效期1年。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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